贵州省某猪场猪瘟病毒感染的诊断

罗险峰，刘 建，汤德元，李春燕

（ 1.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008；2.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

猪 瘟(classic swine fever，CSF)是由猪瘟病毒（CSFV）引起的猪的—种急性、热性和高度接触传染的病毒性传染病。该病的临床特征为发病猪高热稽留、细小血管壁变性导致引起各器官组织的广泛出血、脾梗死等[1-2]。CSF具有高度接触传染性，流行范围广，发病率和死亡率极高，给全球养猪业造成巨大的经济损失[3]。CSF被OIE列为A类传染病，我国也将其列为一类动物传染病。2012 年3月，贵州省某猪场共有存栏猪80头，发病3 d共计死亡10头。为了掌握该猪场疫病的感染状况，对该猪场送检的病料进行流行病学调查、临床症状观察、解剖病理诊断、细菌学检测和RT-PCR技术诊断，最终确诊为猪瘟病毒感染。现将诊断结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

病料：贵州省某猪场送检的发病猪血清10份，发病猪1头。

1.2 主要试剂

鲜血琼脂培养基、普通肉汤培养基、琼脂糖（均购自上海阳光生物技术有限公司）；猪瘟抗体金标检测卡（购自深圳市康百得生物科技有限公司）；猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒（购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司）； DL 2000 DNA Marker（购自大连宝生物工程有限公司）。

1.3 检测方法

1.3.1 流行病学调查 采用向畜主询问的方法，了解猪场发病状况并记录。

1.3.2 临床症状及剖检病理变化对该猪场送检的发病猪进行临床观察及剖检病理变化观察，并记录实验结果。

1.3.3 快速金标检测卡检测血清样本 应用猪瘟病毒抗体快速金标检测卡对送检10份血清进行检测，严格按照检测试剂盒说明书进行操作。

1.3.4 细菌分离 剖检送检病猪后，无菌采集病变明显的肾脏、肺脏、淋巴结和脾脏等组织器官，进行直接触片，分别进行革兰氏和瑞氏染色，镜检。同时将上述病料、关节积液和心血等无菌操作划线接种在普通琼脂平板培养基和鲜血琼脂培养基上，37 ℃恒温培养24 h观察。

1.3.5 RT-PCR检测 按照猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒说明书处理上述收集的淋巴结、肾脏、脾脏、肺脏和肝脏等病料，然后提取病毒总RNA，进行RT-PCR扩增。RT-PCR反应体系：16.8μL RT-PCR反应液(用前混匀)，1.2μL酶混合液，2μL模板RNA，总体积20μL。RT-PCR反应条件：42 ℃ 45 min，95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳观察结果。

2 结果与分析

2.1 发病情况

该猪场共有存栏猪80头，发病3天共计死亡10头。发病猪出现了体表发红，发热、体温升高到40.0～41.0 ℃、稽留不退，衰弱颤抖，病猪先便秘后腹泻。体温开始升高时可见病猪便秘，先排出干燥粪球呈颗粒状，后排出带白色黏液、黏膜或脓血的深褐色粪球等疑似猪瘟症状。

2.2 临床症状及剖检病理变化检测

临床症状：送检病猪被毛粗乱，消瘦，尾根和肛门附近被粪便污染，体温升高(41 ℃左右)，眼角有脓性分泌物，精神抑郁，眼睑水肿，两眼有多量黏脓性分泌物，咳嗽、呕吐、流涎，全身皮肤有明显出血点、出血斑。

剖检病理变化：心包液增多、心肌柔软，肾脏、膀胱、脾脏、喉头、会厌软骨、胆囊、胃和大肠黏膜出血；脾脏明显肿大，边缘或尖端有出血性梗死灶；肝脏边缘钝厚、质硬、切面结构模糊；颌下、肠系膜及腹股沟等处淋巴结肿胀，充血或出血，外表颜色从深红色到紫红色，切面呈红白相间的大理石样。

2.3 快速金标检测卡检测血清样本

应用猪瘟抗体快速金标检测卡对送检的10份发病猪血清进行检测。结果10份送检血清在检测线区（T）及对照线区（C）同时出现了紫红色线（图1），而且检测线区（T）颜色较深，这表明猪体内的猪瘟抗体滴度很高。

2.4 细菌分离

将肝、肺、脾、肾、淋巴结等组织触片，进行革兰氏和瑞氏染色后，在光镜下未见有特征性的细菌生长，普通琼脂培养基和鲜血琼脂培养基上也没有观察到细菌生长，这表明该病例并非细菌感染所致。

2.5 RT-PCR检测结果

剖检送检病猪取其淋巴结、肝脏、肾脏、脾脏和扁桃体等病变组织20 g，按病料与PBS液体积比1∶5加入PBS研磨制成悬液，然后按照猪瘟RT-PCR检测试剂盒说明书提取病毒总RNA，进行RT-PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳后出现了CSFV阳性条带，大小为272 bp，与CSFV阳性对照条带一致，这说明送检的病料中存在CSFV。结果见图2。

3 讨论与分析

1)通过流行病学调查、临床症状观察、剖检病理诊断及猪瘟抗体快速金标检测卡检测，初步诊断该猪场断奶仔猪疑似猪瘟病毒感染。通过对发病猪的淋巴结、肾脏、脾脏、肺脏和肝脏等组织进行细菌检测，结果并未发现细菌感染的存在。RT-PCR结果显示，送检病猪中检出了CSFV核酸阳性条带，表明该猪场已经感染了CSFV野毒。

2）近年来猪场的疾病情况日趋复杂，病毒性疫病的双重感染、三重感染、细菌和多重病毒感染的现象越来越普遍，猪场的发病死亡率越来越高[4]。本次检测结果表明，该猪场仅为猪瘟病毒单一感染。因此，建议该猪场紧急接种猪瘟病毒疫苗，将可疑猪和病猪全部隔离饲养，病死猪及污染物则彻底焚烧或深埋，对污染的圈舍和四周环境进行严格消毒，患病猪群则带猪消毒，同时加强饲养管理并合理投喂抗生素避免其他疫病的继发感染。

3）抗体快速金标检测卡和PCR方法在猪场疫病检测中的联合应用，不仅实现了血清学抗体检测，同时根据血清学抗体检测结果，再进行PCR检测，避免了对病原的盲目判断，从而实现对疫病感染状况的快速诊断。

[1]殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社,1997：652-664.

[2]蔡宝祥.家畜传染病学[M].4版.北京:中国农业出版社,2001：201-206.

[3]Edwards S, Fukusho A, Lefevre P C, et al. Classical swine fever: the global situation[J].Vet Microbiol，2000，13（73）:103-119.

[4]梁大明,陆红梅,高婕,等.浅析我国猪病流行现状及应对策略[J].中国畜牧兽医,2007,34(1):160-161.