Faecalibacterium prausnitzii对实验性结肠炎大鼠Foxp3+Treg细胞的影响

杨晓彤 张明明 洪 娜 邱新运 于成功*

南京大学医学院附属鼓楼医院消化科（210008）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）是一种病因不明的炎症性肠病，目前主要认为该病与免疫、遗传、环境和感染等多种因素有关。调节性T细胞（regulatory T cell,Treg细胞）是一组能抑制其他免疫细胞活化、增殖的细胞亚群，Foxp3作为X染色体编码的叉头蛋白转录因子家族成员之一，是Treg细胞发育、分化和功能发挥必不可少的调节因素[1]。益生菌在UC发病和治疗过程中的作用越来越受到重视。Mazmanian等[2]的研究发现一种肠道共生菌脆弱类杆菌（B.fragilis）对实验性结肠炎动物模型有一定的抗炎作用，这种作用是通过细菌产物多糖 A（PSA）来实现的。Faecalibacterium prausnitzii（FP）是存在于正常人肠道内的共生菌，与正常人相比，UC患者粪便中FP数量明显减少[3]。本实验通过建立2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的实验性结肠炎大鼠模型，并研究FP对TNBS结肠炎的治疗作用，旨在初步探讨其治疗机制。

材料与方法

一、实验动物、细菌、主要试剂和仪器

SPF级 Sprague-Dawley（SD）大鼠 60只，体质量160～200 g，雌雄各半，由南京大学附属南京鼓楼医院实验动物中心提供。

FP（ATCC 27766）购自美国模式培养物集存库（ATCC）；长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）由上海信谊药厂有限公司馈赠。TNBS购自美国Sigma公司；大鼠白细胞介素（IL）-10、转化生长因子（TGF）-β 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自eBioscience公司；大鼠IL-12 ELISA试剂盒购自北京拜尔迪生物技术有限公司。CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE和固定破膜液购自 eBioscience公司；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限公司。流式细胞仪（BD公司）；酶联免疫分析仪（2550型）购自日本Bio-Rad公司。

二、方法

1.实验分组与造模方法：大鼠适应性喂养5 d，称重编号后随机分为正常对照组、结肠炎组、FP组、FP上清液组、培养基组和双歧杆菌组，每组各10只。后5组大鼠禁食不禁水24 h，制备结肠炎模型。采用乙醚麻醉后，将直径约0.2～0.3 cm的橡胶软管插入大鼠结肠距肛门8～10 cm处，以TNBS 80 mg/kg+等体积无水乙醇混合液缓慢推入结肠，将大鼠肛门向上倾斜45°，放置1 min，然后保持平躺状态，自然清醒。正常对照组以0.9%NaCl溶液80 mg/kg+等体积无水乙醇混合液灌肠作为对照，其余过程均相同。

2.干预方法：将生长24 h的细菌培养基混合液离心，菌体以PBS洗涤2次后悬于PBS溶液中，密度调整至109/ml。上清液冻干成粉状，以PBS溶解，浓度为原上清液的5倍。造模成功24 h后，正常对照组、结肠炎组大鼠每日1 mL PBS灌胃，FP组、双歧杆菌组分别以1 mL FP细菌悬液和长双歧杆菌悬液灌胃，FP上清液组、培养基组分别以1 mL FP上清液和FP培养基灌胃，连续7 d。处死大鼠后取距肛门6 cm处结肠组织行病理切片，并取外周血和脾脏。

3.结肠炎组织病理学评估：大鼠结肠组织以4%多聚甲醛溶液固定24 h，脱水、透明、浸蜡后进行组织包埋，切片后行HE染色，镜下观察。参照Neurath等[4]的研究，行病理学评分：0分为无炎症；1分为很少量粒细胞浸润；2分为少量炎性细胞浸润；3分为大量炎性细胞浸润，血管增多，结肠壁增厚；4分为透壁性炎症，杯状细胞减少，血管增多和结肠壁增厚。

4.外周血和脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例的检测：取大鼠腹主动脉血2 mL，以肝素抗凝，按淋巴细胞分离液说明书分离全血淋巴细胞。摘取大鼠脾脏后去外膜，切成0.5 cm×0.5 cm的小块，用200目不锈钢筛网研磨。将全血淋巴细胞和脾脏细胞溶于流式染色缓冲液后，将细胞数调至106/管，分别加入 CD4-FITC1.0 μg 和 CD25-APC 0.4 μg 单克隆抗体，4℃避光孵育1 h；清洗离心后，固定/透化工作液4℃避光孵育50 min穿孔；加入Foxp3-PE 1.0 μg，4 ℃避光孵育 1 h，清洗 2 遍后，上流式细胞仪检测。

5.外周血细胞因子的检测：大鼠腹主动脉取血2 mL，以肝素抗凝，离心取上清，按照ELISA试剂盒说明书检测IL-10、IL-12和TGF-β含量。

三、统计学分析

结 果

一、一般情况

正常对照组大鼠因麻醉意外死亡1只；培养基组大鼠因严重肠梗阻死亡2只；双歧杆菌组因麻醉意外死亡1只，严重肠梗阻死亡1只，斗殴致外伤死亡1只。

造模后第2 d，结肠炎组大鼠开始出现腹泻，为黄色稀便、半稀便甚至血便；大鼠毛色失去光泽，进食和活动明显减少，体质量明显下降，反应迟钝。给予干预7 d后，FP组、FP上清液组和双歧杆菌组大鼠腹泻好转，大便转为黄色，稍稀或干便，精神逐渐恢复正常，毛色恢复光泽，进食和活动逐渐增多。正常对照组和培养基组大鼠无上述各种变化。

二、结肠大体形态和组织病理改变

正常对照组和培养基组大鼠结肠黏膜上皮完整，无充血水肿，黏膜下血管正常，腺体排列整齐；结肠炎组大鼠结肠黏膜不同程度充血、水肿，有溃疡形成，以结肠下段明显，镜下可见大量炎性细胞浸润，黏膜和黏膜下层血管扩张、增多，腺体结构紊乱；FP组、FP上清液组和双歧杆菌组可见少量炎性细胞浸润，黏膜稍有充血、水肿，血管增生不明显，其中FP上清液组疗效更为明显（见图1）。

与正常对照组相比，结肠炎组病理学评分显著升高（P<0.01）。与结肠炎组相比，FP组、FP上清液组和双歧杆菌组病理学评分显著下降（P<0.05），而FP组和FP上清液组与双歧杆菌相比无明显差异（见表 1）。

表1 各组大鼠组织病理学评分以及外周血和脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞比例比较（）

表1 各组大鼠组织病理学评分以及外周血和脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞比例比较（）

与正常对照组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与结肠炎组比较，*P<0.05，**P<0.01；#与培养基组比较，P<0.05

三、外周血和脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例

与正常对照组相比，结肠炎组大鼠外周血和脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例显著降低（P<0.05）；经FP和FP上清液治疗后，其比例显著增高（P<0.05），而双歧杆菌与结肠炎组相比无明显差异；FP上清液组外周血和脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例明显高于培养基组（P<0.05）（见表1）。

四、血浆 IL-10、IL-12 和 TGF-β 含量

与正常对照组相比，结肠炎组大鼠血浆IL-10和TGF-β含量显著降低（P<0.05），IL-12含量显著升高（P<0.01），IL-10/IL-12 比值显著降低（P<0.01）；经FP、FP上清液和双歧杆菌治疗后，IL-10含量有升高趋势，但差异无统计学意义，IL-12含量明显下降（P<0.05），IL-10/IL-12 比值显著升高（P<0.01），TGF-β 含量显著增高（P<0.05）；FP上清液组 IL-10/IL-12比值和TGF-β含量均显著高于培养基组（P<0.05）（见表 2）。

讨 论

UC是一种病因未明的肠道非特异性炎性疾病，机体对包括肠道微生物在内的各种因素产生了异常免疫反应。人体消化道寄生着大量细菌，在机体免疫系统正常的情况下，这些细菌与肠道黏膜之间维持免疫平衡和耐受。如某种因素导致肠道菌群失调，即会打破这种平衡，导致肠道黏膜受损，从而引发肠道炎症。肠黏膜上皮细胞和免疫细胞通过Toll样受体和NOD样受体特异性识别细菌的分子配体，而这种相互作用能调节肠道炎症反应[5]。Kruis等[6]的研究发现大肠杆菌Nissle 1917对UC维持缓解的疗效及其安全性与金标准的美沙拉秦相似；另一项随机双盲对照试验[7]显示，长双歧杆菌与益生元（Synergy 1）的产物合生元可改善18例急性UC患者的症状和炎症反应，说明益生菌在抑制UC炎症方面起有重要的作用。

肠道黏膜免疫-炎症反应异常在UC发病中起有重要作用，T细胞是参与这一过程的主要免疫细胞，通过TCR介导识别抗原、活化后，发挥细胞毒作用或通过分泌细胞因子发挥调节作用。与Th1细胞和Th2细胞不同，Treg细胞是一类具有免疫调节功能的T细胞亚群，在多种免疫性疾病中起重要作用，虽然其具体的细胞分子通路尚不清楚，但越来越来多的证据表明Treg细胞能通过多种机制来抑制免疫应答。体外实验证明Treg细胞能抑制其他T细胞的活性，其机制可能是直接通过细胞间的接触依赖，或通过间接调节抗原呈递细胞的活性[8,9]。目前发现在体内Treg细胞也能抑制固有免疫反应，但能否抑制非T细胞介导的免疫反应尚不清楚。转录因子Foxp3是CD4+CD25+Treg细胞的特异性标记物，是发育的关键调节基因。Brunkow等[10]首先在Scurfy小鼠中证实了Foxp3基因更多表达于CD4+T细胞中；Foxp3是fox蛋白家族成员之一，在CD4+CD25+Treg细胞发育和功能发挥中起重要作用[11]。有研究发现，Foxp3基因突变或敲除的小鼠体内CD4+CD25+Treg细胞数量明显下降，并伴有调节功能缺陷，可诱发严重的自身免疫反应，因此，Foxp3对机体免疫系统的稳定性起关键作用[12]。

动物实验[13]证实细胞因子如IL-10和TGF-β在Treg细胞发挥抑制肠道炎症的功能中起重要作用。这些分子能对T细胞和其他固有免疫细胞起多种抑制效应。IL-10是体内重要的抑炎因子，能抑制肿瘤坏死因子（TNF）-α 的分泌，上调 IL-1RA/IL-β 比值，影响干扰素（IFN）-γ的产生。IL-10基因缺失小鼠会发生以促炎细胞因子分泌紊乱为特征的自发性肠道炎症[14]。IL-12是细胞免疫中的重要因子，能通过促进T细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）的产生而增加IFN-γ、IL-2、IL-8的生成，从而抑制Th2细胞并促进Th1细胞的作用。IL-10/IL-12比值常用于衡量抑炎效应。

本实验中通过给予结肠炎模型大鼠FP及其上清液干预治疗，结果发现肠道炎症病理改变明显缓解，糜烂、水肿、炎性细胞浸润等明显减轻；同时外周血和脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例和血浆TGF-β含量明显提高，IL-10含量虽无明显差异，但呈升高趋势，IL-12含量明显降低，IL-10/IL-12比值明显升高。FP及其上清液治疗结肠炎可能的原因为：①FP及其上清液能调节免疫功能，通过增加Foxp3的表达，改善肠道免疫状态，减轻肠道局部炎症反应，使紊乱的肠道免疫系统恢复；②FP及其上清液可增加外周血和脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例，使其对全身免疫系统构成良性循环，有利于整个机体免疫功能的恢复；③TGF-β含量增加，使原始T细胞更多的向Treg细胞方向转化，从而扭转T细胞亚群的不平衡，而IL-10能通过旁分泌的形式维持Treg细胞Foxp3转录因子的表达。

表2 各组大鼠血浆IL-10、IL-12、TGF-β 含量比较（）

表2 各组大鼠血浆IL-10、IL-12、TGF-β 含量比较（）

与正常对照组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与结肠炎组比较，*P<0.05，**P<0.01；#与培养基组比较，P<0.05

总之，本实验通过给予实验性结肠炎模型大鼠补充FP及其上清液，发现其可通过增加Foxp3的表达而提高外周血和脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例，从而对UC发挥一定的治疗效果，但其更具体的作用组分以及机制尚有待今后研究进一步探讨证实。

1 孔珍珍,李付广.Foxp3在CD25+CD4+调节性T细胞发育和功能中作用的研究进展[J].国际免疫学杂志,2010,33(3):205-208.

2 Mazmanian SK,Round JL,Kasper DL.A microbial symbiosis factor prevents intestinal inflammatory disease[J].Nature,2008,453(7195):620-625.

3 Sokol H,Seksik P,Furet JP,et al.Low counts of Faecalibacterium prausnitziiin colitismicrobiota[J].Inflamm Bowel Dis,2009,15(8):1183-1189.

4 Neurath MF,Fuss I,Kelsall BL,et al.Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice[J].J Exp Med,1995,182(5):1281-1290.

5 Marteau P,Sokol H,Dray X,et al.Bacteriotherapy for inflammatory boweldisease:therapeutic tooland/or pharmacological vectors[J]?Gastroenterol Clin Biol,2009,33 Suppl 3:S228-S234.

6 Kruis W,Fric P,Pokrotnieks J,et al.Maintaining remission of ulcerative colitis with the probiotic Escherichia coli Nissle 1917 is as effective as with standard mesalazine[J].Gut,2004,53(11):1617-1623.

7 Furrie E,Macfarlane S,Kennedy A,et al.Synbiotic therapy (Bifidobacterium longum/Synergy 1)initiates resolution ofinflammation in patients with active ulcerative colitis:a randomised controlled pilot trial[J].Gut,2005,54(2):242-249.

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