气相色谱法测定饲料中BHT和EQ两种抗氧化添加剂

上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所 董茂锋 白 冰 饶钦雄 宋卫国 杨海锋 赵志辉

2，6-二叔丁基对甲酚 （BHT）和乙氧基喹啉（EQ）是目前应用最广泛的两种通用型酚类抗氧化剂（熊中强等，2011）。作为饲料添加剂，其对于改善饲料的品质，防止饲料中维生素等营养成分的氧化变质有重要的作用。由于BHT和EQ组成的抗氧化饲料添加剂具有高浓度含量的特点以及复杂的饲料基质，从而使在检测过程中按照一般的残留分析方法不能实现准确的含量测定。近几年来，对于抗氧化剂的测定，主要有气相色谱法和液相色谱法（杨晓凤，2011；李秀勇等，2008；穆同娜等，2008；郭岚等，2007；胡小钟等，2000）。 但是对于添加剂中的BHT和EQ分析报道较少，本研究以广泛的应用性和分析准确性为基础，通过目前应用广泛的前处理方式，以及对前处理过程中的条件优化，建立了气相色谱法测定饲料中两种抗氧化添加剂BHT和EQ含量的方法。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 BHT和EQ标准品 （纯度≥98%，购于SIGMA），用异丙醇溶解配制为1000 mg/L的标准贮备液，从中分别取一定量的贮备液用异丙醇稀释成100 mg/L的标准工作液，2～8℃下保存1个月；异丙醇、甲醇、乙腈和丙酮为分析纯。超声仪。

1.2 色谱条件 色谱柱：DB-17ms柱，30.0 m×0.32 mm × 0.25 μm；载气：N2；流速：2.0 mL/min；升温程序：100℃保持1 min，然后以15℃/min速度升至210℃，再以40℃/min速度升至260℃保持1.5 min；进样口温度：230℃；检测器温度：300℃；空气流量：380 mL/min；氢气流量：40 mL/min；进样量：1 μL。

1.3 样品的制备提取 称取1.0 g试样置入150 mL棕色容量瓶中，加入100 mL异丙醇，置于超声仪中超声提取4 h，取上清液 （样品提取液）2 mL，过 0.22 μm 滤膜，装入进样小瓶，待测；若样品中BHT和EQ的含量过高，超出线性范围，则取上清液1 mL，用异丙醇稀释，过0.22 μm滤膜，装入进样小瓶，待测。

2 结果与讨论

2.1 检出限和线性范围 从测定标准溶液（S/N＜20的浓度）所得到色谱图中，以3倍信噪比（S/N＝3）为检测限（LOD），以 10 倍信噪比（S/N≥10）为定量限（LOQ），计算所得BHT和EQ的检出限分别为0.015%和0.020%，定量限分别为0.045%和0.06%。

用异丙醇配制一系列标准工作液，BHT和EQ 的浓度分别为 900、600、400、200、100、50、25 mg/L 和 900、600、300、150、75、37.5 mg/L，浓度由低至高进样测定，以峰面积和质量浓度计算。BHT和EQ的标准曲线和回归方程见图1。

2.2 样品提取溶剂和提取时间的选择 溶剂作为影响提取样本中目标化合物的最重要因素，本试验选取了极性差别较大的5种常规溶剂作为考察对象。称取混合均匀的饲料抗氧化添加剂0.5 g，分别加入100 mL异丙醇、甲醇、乙腈、丙酮和正己烷5种溶剂，比较BHT和EQ在不同溶剂中提取效果。由于抗氧化添加剂中BHT和EQ的含量比较高，且目标化合物容易被空气氧化，因此提取时间的长短是影响提取效果的重要因素。

由图2可见，5种溶剂对BHT和EQ均有一定的提取效果，且在提取4 h后，BHT和EQ的含量不再有较大的变化，但是异丙醇的提取效果最佳。选取异丙醇为提取溶剂时，BHT和EQ的提取含量最高，分别为3.62%和14.00%，而正己烷对BHT的提取效果最差为3.07%，乙腈对EQ的提取效果最差为12.46%。

2.3 提取溶剂体积的优化 除溶剂种类和提取时间外，提取溶剂的体积量也是前处理过程中影响BHT和EQ提取效果的主要因素之一。根据2.1中的结果，选用异丙醇为提取溶剂，提取时间为4 h，考察提取不同提取溶剂体积和称样质量比例对BHT和EQ的提取效果的影响，结果见图3。

保持样品称样量不变，改变异丙醇的体积，4 h超声提取后，观察不同异丙醇体积提取的样品中BHT和EQ的含量。实验选取了4个考察点，异丙醇和样品质量的比分别是100，140，200 mL/g和400 mL/g。由图3可见，样本中BHT和EQ的含量在4个不同体积和样品量的实验设定中，BHT的含量变化范围为3.10%～3.35%，相对偏差为3.55%，而EQ的含量变化范围为14.53%～15.04%，相对偏差为1.45%，相对偏差均小于5%。实验结果表明，当异丙醇提取体积与称样量的比例在100～400 mL/g的范围内，增加异丙醇的提取体积，BHT和EQ的含量无明显提升，说明对于1.0 g样品中的BHT和EQ，100 mL异丙醇可完全提取出全部的BHT和EQ。

2.4 方法的准确度和精确度测定 通过上述的前处理提取的优化，确立了1.0 g样品添加100 mL异丙醇超声提取4 h的前处理方法，实验通过3个不同浓度的添加水平以及3个重复实验验证方法的准确度和精确度，检测结果见表1。由表1可见，方法的回收率为77.89%～90.53%，相对标准偏差为2.27%～8.35%。

2.5 BHT和EQ在空气中的氧化速度测定BHT和EQ的主要作用是防止添加对象中某些易被氧化的物质被氧化，从而延长添加对象的保质期。因此BHT和EQ在接触空气过程中，其被氧化的能力和速度成为其作为抗氧化剂的一个重要指标。称取50.0 g含有一定质量的BHT和EQ样本放置在表面皿中，放于常温实验室内，观察其在50 d内BHT和EQ的氧化情况。隔一定时间称取混合均匀的样品按照已经建立的抗氧化剂中BHT和EQ的检测方法测定BHE和EQ的含量，结果见图4。

表1 饲料添加剂中的BHT和EQ的添加回收率测定结果%

由图4可见，在50 d内，BHT的含量从3.62%降到0.052%，而EQ的含量则从14%降到6.27%。在前7 d，BHT和EQ的氧化速度最快，分别从3.62%和14%降到1.03%和7.4%；在第7天到第28天内，BHT的氧化效果明显，从1.03%氧化到0.29%，而EQ的氧化效果不明显，保持在7.23%～7.4%范围内；第28天到第50天，BHT氧化率为0.08%，而EQ首先在第28天从7.3%快速被氧化到第40天的6.36%后，从第40天到第50天未出现明显氧化现象。结果表明，BHT和EQ在最初的7 d内被氧化的速度最快，而BHT的被氧化能力明显高于EQ的被氧化能力，在BHT存在的前提下，EQ能够在7～28 d和40～50 d的两个阶段保持含量未发生明显变化。

3 结论

通过对不同提取溶剂、提取时间以及提取溶剂量三方面的考察，建立了合理简单符合分析化学要求的通过异丙醇超声提取4 h采用GC-FID测定饲料中BHT和EQ含量的分析方法，为抗氧化剂中的BHT和EQ的含量测定提供检测分析方法。该方法BHT和EQ方法检出限分别为0.015%和0.02%，添加回收率为77.89%～90.53%，相对标准偏差为2.27%～8.35%。实验考察了BHT和EQ在空气中的被氧化能力，并总结出在暴露空气室温条件下，BHT和EQ的氧化规律，为相关的BHT和EQ的作为抗氧化剂使用提供参考。

[1]郭岚，谢明勇，郑爱平，等.气相色谱-质谱法同时测定食用植物油中三种抗氧化剂[J].分析科学学报，2007，23（2）：169 ～ 172.

[2]胡小钟，余建新，钱浩明，等.油脂中九种抗氧化剂的反相高效液相色谱法分离和测定[J].分析科学学报，2000，16（1）：23 ～ 26.

[3]李秀勇，刘蕙涛，胡之德.超高效液相色谱-质谱法测定油脂中的10种抗氧化剂[J].分析化学研究简报，2008，36（3）：369 ～ 372.

[4]穆同娜，许华，李伟，等.凝胶渗透色谱净化-气相色谱法食用油中抗氧化剂 BHA、BHT[J].食品工业科学，2007，28（1）：228 ～ 230.

[5]熊中强，王利兵，李宁涛，等.气相色谱法测定高分子食品包装材料中抗氧化剂的残留量[J].色谱，2011，29（3）：273 ～ 276.

[6]杨晓凤.凝胶渗透色谱净化-气相色谱法同时测定饲料中4种抗氧化剂[J].中国饲料，2011，5：38 ～ 44.