超高压结合酶法消减南美白对虾虾肉中的过敏原

2012-10-18谢丹丹胡志和张博洋

食品科学 2012年3期

关键词：虾肉物质量白对虾

谢丹丹，胡志和*，薛璐，张博洋

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

超高压结合酶法消减南美白对虾虾肉中的过敏原

谢丹丹，胡志和*，薛璐，张博洋

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

以虾肉为原料，研究超高压对酶法消减南美白对虾虾肉过敏原的强化作用。将南美白对虾去头、去尾、去壳、去肠线后用匀浆机匀浆，制成虾肉酱，分别采用超高压法、超高压处理后再用木瓜蛋白酶水解、超高压条件下直接酶解的方法消减其过敏原，用间接酶联免疫吸附法检测过敏原消减效果，确定消减过敏原的条件。结果表明：采用超高压法处理，其最佳条件为：压力200MPa、温度40℃、保压时间35min，此条件下产物与抗体反应的OD492nm值为0.1986；先超高压处理再用木瓜蛋白酶水解，其水解的最佳条件为：底物质量浓度10g/100mL、温度60℃、酶与底物质量比1∶200，此条件下产物与抗体反应的OD492nm值为0.0487；超高压条件下直接用木瓜蛋白酶处理，其最佳条件为：压力300MPa、温度40℃、保压时间35min，产物与抗体反应的OD492nm值为0.0516。由此可见，超高压处理对南美白对虾过敏原有消减作用，先超高压处理再用木瓜蛋白酶水解和超高压条件下直接酶处理对过敏原的消减效果更好。

南美白对虾；超高压结合酶法；过敏原消减；酶联免疫

根据统计，美国大约有6%的幼儿和3.7%的成年人对某些食品过敏[1-2]，每年平均有100～125人死于食品过敏[3]，其中海产品就是引起过敏的食品中的一种[4-5]。中国疾病预防控制中心营养与食品安全所调查的数据显示，在15～24岁年龄段的健康人群中，大约有6%的人曾经患有食品过敏性疾病[6]。近年来也出现了许多关于食用海产品致敏的报道[7-12]。食物过敏已经严重威胁到人类的健康，甚至会对人类的生命安全造成极大危害[13]。本实验以南美白对虾为研究对象，采用超高压法、超高压处理后再用木瓜蛋白酶水解、超高压条件下直接用木瓜蛋白酶水解的方法处理虾肉，通过间接酶联免疫技术对处理后的过敏原的消减程度进行检测，比较其消减效果，为制备低过敏原的虾肉制品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活南美白对虾市售。

海虾过敏人血清(3个过敏者血清混合)以及非过敏人血清(30个非过敏者血清混合)由天津商业大学校医院提供，血清置于－25℃冰箱冻存。

木瓜蛋白酶(Papain，0.5～2U/mg)、HRP 标记的羊抗人IgE抗体A9667 美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HPP.L3型超高压设备天津市华泰森淼生物工程技术有限公司；DK-42型电热恒温水浴槽上海精宏实验设备有限公司；Sartorius PB-10 pH计德国赛得利斯(北京)有限公司；3-18K型离心机美国Sigma公司；Scientz-50N冷冻干燥机宁波新芝生物科技股份有限公司；FA1104N型电子天平上海精密科技仪器有限公司；RT-6000型酶标分析仪深圳雷杜生命科学股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 南美白对虾虾肉样品处理

将南美白对虾去头、去尾、去壳、去肠线后用匀浆机匀浆，匀浆时，每1g组织加入1mL生理盐水，制成虾肉浆，置于－20℃冰箱保存备用。

1.3.2 超高压法对南美白对虾虾肉过敏原消减效果的影响

在前期单因素试验基础上，以压力、温度及保压时间为影响因素，以492nm波长处的OD值为考察目标(每组做6个平行，取平均值)，进行L9(33)正交试验。

1.3.3 超高压处理后再用木瓜蛋白酶水解消减南美白对虾虾肉过敏原的条件研究

1.3.3.1 超高压处理后再用木瓜蛋白酶水解消减虾肉过敏原的单因素试验条件

用1.3.2节优化的条件，先将虾肉进行超高压处理，再对虾肉进行木瓜蛋白酶水解。以底物质量浓度、温度、酶与底物质量比为影响因素。具体单因素试验为：在温度60℃、酶与底物质量比1∶100、水解时间3h、pH6.5 的条件下，改变底物质量浓度(5、10、15、20g/100mL)进行水解；在温度 60℃、底物质量浓度10g/100mL、水解时间3h、pH6.5的条件下，改变酶与底物质量比(1∶50、1∶100、1∶200、1∶400)进行水解；在底物质量浓度 10 g/100mL、酶与底物质量比1∶100、水解时间3h、pH6.5的条件下，改变水解温度(50、55、60、65℃)进行水解。

1.3.3.2 超高压处理后再用木瓜蛋白酶水解消减南美白对虾虾肉过敏原条件优化

先将虾肉进行超高压处理(超高压法处理虾肉的最优条件为：压力200MPa、温度40℃、保压时间35min)，再对虾肉进行木瓜蛋白酶水解。根据单因素试验结果，以底物质量浓度、温度以及酶与底物质量比为影响因素，以492nm波长处的OD值为考察指标(每组做6个平行试验，取平均值)，进行L9(33)正交试验。

1.3.4 超高压条件下直接用木瓜蛋白酶水解消减南美白对虾虾肉过敏原条件优化

将木瓜蛋白酶与虾肉同时进行超高压处理，将虾肉的pH值调至6.5，综合方法1.3.2节的试验结果(即压力200MPa、温度40℃、保压时间35min)和方法1.3.3.2节的试验结果(底物质量浓度10g/100mL、温度60℃、酶与底物质量比1∶200)，设计超高压条件下直接用木瓜蛋白酶水解虾肉中过敏原蛋白的因素和水平。以492nm波长处的OD值为评价指标(每组做6个平行试验，取平均值)，进行L9(33)正交试验。

1.3.5 间接酶联免疫检测过敏原

1.3.5.1 样品的制备

将各个条件处理后的虾肉于4℃、10000r/min离心15min，取上清液，再冷冻干燥，所得的虾肉冻粉即抗原，将该抗原与包被液(100mL含0.16g Na2CO3、0.29g NaHCO3)配成质量分数为1%的溶液，即为待测物。

1.3.5.2 检测

包被抗原时每个样品做6个平行孔，在酶标板上每孔加100μL待测物，于4℃包被过夜。用洗液洗5次，每次3min，拍干。每孔加封闭液200μL(100mL PBST缓冲液含1g牛血清白蛋白(BSA)，37℃水浴3h，洗涤后拍干，每孔加入100μL一抗(用封闭液稀释20倍的过敏人血清)，37℃水浴2h，洗涤后拍干，加入用HRP 标记的羊抗人IgE(用封闭液稀释200倍的二抗)，37℃水浴2h。洗涤拍干，每孔加邻苯二胺100μL，37℃显色15min，每孔加50μL终止液(2mol/L H2SO4)，最后在492nm波长处测定OD值[14]。检测时用未处理的虾肉冻干粉作为阳性对照，用正常人血清为一抗作阴性对照。

2 结果与分析

2.1 超高压法对南美白对虾虾肉过敏原消减效果的影响

由表1可知，通过超高压处理虾肉所得的产物，经酶联免疫检测，得出3个因素对OD值的影响大小依次为A＞B＞C，即压力＞温度＞保压时间，较好的实验方案为A2B2C3，即压力200MPa、温度40℃、保压时间35min，此条件下处理产物与抗体反应的OD492nm值为0.1986。该值虽不在正常人血清与抗体反应的OD492nm值范围(0.03～0.05)内，但是较阳性对照(阳性对照值为0.5850±0.0142)已经有很大程度的降低。超高压处理主要作用于非共价键，能够破坏蛋白质的空间结构，从而使过敏原的表位被掩盖或者被破坏，因此，超高压技术能够对虾肉中过敏原的消减起到一定的作用。

表1 超高压法消减虾肉过敏原正交试验结果(，n=6)Table 1 Orthogonal array design and results for optimizing allergen elimination from Litopenaeus vannamei by ultra-high pressure treatment (x± s，n=6)

试验号 A压力/MPa B温度/℃ C保压时间/min 平均OD492nm 1 1(150) 1(35) 1(25) 0.2718±0.0234 2 1 2(40) 2(30) 0.2767±0.0232 3 1 3(45) 3(35) 0.2497±0.0167 4 2(200) 1 2 0.2354±0.0129 5 2 2 3 0.1986±0.0143 6 1 0.2425±0.0173 7 3(250) 1 3 0.3442±0.0169 8 3 2 1 0.2968±0.0241 2 3 2 0.2874±0.0281 K1 0.7982 0.8514 0.8111 K2 0.6765 0.7721 0.7995 K3 0.9284 0.7796 0.7925 k1 0.2661 0.2838 0.2704 k2 0.2255 0.2574 0.2665 k3 0.3095 0.2599 0.2642 R 0.0840 0.0264 0.0062最优水平 A2 B2 C3 9 3 3

2.2 超高压处理后再用木瓜蛋白酶水解消减虾肉过敏原的效果

2.2.1 超高压处理后再用木瓜蛋白酶水解消减南美白对虾虾肉过敏原的单因素试验结果

表2 超高压处理后再用木瓜蛋白酶水解消减虾肉过敏原单因素试验结果(，n=6)Table 2 Results of one-factor-at-a-time experiments on allergen elimination from Litopenaeus vannamei by ultra-high pressure treatment followed by papain hydrolysis (x± s，n=6)

组别 A底物质量 B温度/℃ C酶与底物平均OD492nm值浓度/(g/100mL) 质量比1 5 60 1∶100 0.0973±0.0271 2 10 60 1∶100 0.0538±0.0059 3 15 60 1∶100 0.0742±0.0213 4 20 60 1∶100 0.0818±0.0197 5 10 60 1∶50 0.0542±0.0206 6 10 60 1∶100 0.0538±0.0218 7 10 60 1∶200 0.0487±0.0128 8 10 60 1∶400 0.0523±0.0216 9 10 50 1∶100 0.0543±0.0184 10 10 55 1∶100 0.0712±0.0189 11 10 60 1∶100 0.0538±0.0274 12 10 65 1∶100 0.0732±0.0174阳性对照组 0.5850±0.0142阴性对照组 0.0383±0.0010

由表2可知，先用超高压处理(压力200MPa、温度40℃、保压时间35min)的虾肉再用木瓜蛋白酶水解，水解产物与抗体反应的OD492nm值较阳性对照的OD492nm值都有所降低。当底物质量浓度不同时，底物质量浓度为10g/100mL时，水解产物与抗体反应的OD492nm值(0.0538)较低；当酶与底物质量比不同时，酶与底物质量比为1∶200时，水解产物与抗体反应的OD492nm值(0.0487)较低，在1∶400时又开始升高，因此，在正交试验中可考察酶与底物质量比为1∶300的消减效果；当温度不同时，温度为60℃时，水解产物与抗体反应的OD492nm值(0.0538)较低。

2.2.2 超高压处理后再用木瓜蛋白酶消减虾肉过敏原的正交试验条件优化

表3 超高压处理后再用木瓜蛋白酶水解消减虾肉过敏原正交试验结果(，n=6)Table 3 Orthogonal array design and results for optimizing allergen elimination from Litopenaeus vannamei by ultra-high pressure treatment followed by papain hydrolysis (x± s，n=6)

试验号 A底物质量 B温度/℃ C酶与底物平均OD492nm值浓度/(g/100mL) 质量比1 1(5) 1(55) 1(1∶100) 0.0981±0.0258 2 1 2(60) 2(1∶200) 0.0852±0.0262 3 1 3(65) 3(1∶300) 0.1064±0.0231 4 2(10) 1 2 0.0532±0.0261 5 2 2 3 0.0514±0.0168 6 1 0.0732±0.0174 7 3(15) 1 3 0.1085±0.0208 8 3 2 1 0.0742±0.0213 2 3 2 0.0974±0.0242 K1 0.2897 0.2589 0.2455 K2 0.1778 0.2108 0.2358 K3 0.2801 0.2770 0.2663 k1 0.0966 0.0863 0.0818 k2 0.0593 0.0703 0.0786 k3 0.0934 0.0923 0.0888 R 0.0373 0.0220 0.0102最优水平 A2 B2 C2 9 3 3

由表3可知，先用超高压处理(压力200MPa、温度40℃、保压时间35min)的虾肉再用木瓜蛋白酶水解，其水解产物经酶联免疫检测，得出3个因素对OD492nm值的影响大小依次为A＞B＞C，即底物质量浓度＞温度＞酶与底物质量比，较好的试验方案为A2B2C2，即底物质量浓度10g/100mL、温度60℃、酶与底物质量比1∶200，经验证实验得，此条件下水解产物与抗体反应的OD492nm值为0.0487。该值在正常人血清与抗体反应的OD值范围内。

超高压处理能够破坏蛋白质的空间结构，从而使过敏原的表位被掩盖或者被破坏，一定程度上降低虾肉的致敏性；此外，超高压能够使过敏原优先释放到溶液中，这样就更加有利于木瓜蛋白酶的水解，从而使先超高压处理再用木瓜蛋白酶水解虾肉达到较好的过敏原消减效果。

2.3 超高压条件下直接用木瓜蛋白酶水解消减南美白对虾虾肉过敏原效果

表4 超高压条件下直接用木瓜蛋白酶水解消减虾肉过敏原正交试验结果(，n=6)Table 4 Orthogonal array design and results for optimizing allergen elimination from Litopenaeus vannamei by ultra-high pressure treatment in the presence of papain (，n=6)

试验号 A压力/MPa B温度/℃ C保压时间/min 平均OD492nm值1 1(200) 1(40) 1(20) 0.0754±0.0138 2 1 2(45) 2(35) 0.0683±0.0125 3 1 3(50) 3(50) 0.0986±0.0164 4 2(300) 1 2 0.0516±0.0053 5 2 2 3 0.0686±0.0341 6 1 0.0587±0.0172 7 3(400) 1 3 0.0548±0.0184 8 3 2 1 0.0807±0.0243 2 3 2 0.0647±0.0134 K1 0.2423 0.1818 0.2148 K2 0.1789 0.2176 0.1846 K3 0.2002 0.2220 0.2256 k1 0.0808 0.0606 0.0716 k2 0.0596 0.0725 0.0615 k3 0.0667 0.0740 0.0752 R 0.0212 0.0134 0.0137最优水平 A2 B1 C2 9 3 3

由表4可知，通过超高压结合酶法处理虾肉所得的产物，经酶联免疫检测，得出3个因素对OD492nm值的影响大小依次为A＞C＞B，即压力＞保压时间＞温度，较好的试验方案A2B1C2，即压力300MPa、温度40℃、保压时间为35min，产物与抗体反应的OD492nm值为0.0516，该值接近正常人血清与抗体反应的最大OD值。

3 讨论

国内外已经有很多对虾过敏原的消减研究，顾可飞等[15]利用辐照处理对虾过敏原进行消减，发现虾过敏原经辐照处理后，免疫活性有所降低。李振兴[16]的研究发现辐照和加热联合作用可以显著降低虾过敏原蛋白的免疫活性，同时他还对超声波消减虾过敏原进行了研究，发现在50℃条件下的超声波能够对虾的免疫活性产生明显影响。经过1.5h的处理后，其免疫活性只有未处理虾肉的20%。李庆丽等[17]发现麦芽糖、葡萄糖均使虾过敏原蛋白免疫活性有所降低，其中，麦芽糖使虾过敏原蛋白活性下降了60%，葡萄糖可使虾过敏原蛋白活性下降约10%。吴海明等[18]对木瓜蛋白酶水解南美白对虾虾肉进行了研究，发现过敏原消减的最佳条件为：酶与底物质量比1∶100、底物质量浓度5g/100mL、pH6.5、温度60℃，与过敏人血清反应的OD492nm值为0.049，虽然该值在正常人血清与抗体反应的OD值范围内，但是同一正交试验的其他条件所得产物与抗体反应的OD值大部分都大于0.1。本实验的后两种方法所得产物与抗体反应的OD值大部分都在0.1以下，这一结果表明，超高压结合酶法对海虾过敏原的消减具有增强作用。董晓颖等[19]通过100～500MPa压力处理虾过敏蛋白，经过不同压力处理后分子质量大小没有发生变化；Kim等[20]报道了超高压处理使虾过敏蛋白致敏性有所降低，这些研究结果表明单独使用超高压的方法，只对过敏原的空间表位产生影响，而不能消除线型表位，本实验研究结果与之一致。另外也有关于超高压法消减大米中过敏原的报道[21]。

本研究利用超高压法、超高压处理后再用木瓜蛋白酶水解、超高压条件下直接酶解对南美白对虾虾肉过敏原进行消减，3种方法对虾肉过敏原均有消减作用。超高压处理后再用木瓜蛋白酶酶解以及超高压条件下直接酶解的产物的抗原抗体反应OD492nm值均接近或在正常人血清与抗体反应的OD492nm值范围内，表明超高压结合酶法对南美白对虾虾肉过敏原的消减有增强作用。

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Allergen Elimination fromLitopenaeus vannameiMeat by Ultra-high Pressure Treatment Coupled with Papain Hydrolysis

XIE Dan-dan，HU Zhi-he*，XUE Lu，ZHANG Bo-yang
(Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

The aim of this study was to investigate the synergistic effect of ultra-high pressure treatment and papain hydrolysis on allergen elimination from the meat ofLitopenaeus vannamei. FreshLitopenaeus vannameiwas homogenized after removing the head, tail, shell, and catgut. Three methods, ultra-high pressure treatment, ultra-high pressure treatment followed by papain hydrolysis and simultaneous ultra-high pressure treatment and papain hydrolysis were used to eliminate allergens from theLitopenaeus vannameihomogenate. Indirect ELISA was used to evaluate the results of allergen elimination and the optimal conditions for allergen elimination were explored. The results showed that the optimal conditions for allergen elimination by ultrahigh pressure treatment were 200 MPa, 35 min and 40 ℃. Under these conditions, the optical density at 492 nm (OD492nm) after the reaction between antibody and treatedLitopenaeus vannameihomogenate was 0.1986. The optimal conditions for ultra-high pressure treatment followed by papain hydrolysis were substrate concentration of 10 g/mL, hydrolysis temperature of 60 ℃ and enzyme-to-substrate ratio of 1∶200, resulting in an OD492 nm of 0.0487. The optimal conditions for simultaneous ultra-high pressure treatment in the presence of papain were 300 MPa, 35 min and 40 ℃, which revealed an OD492nm of 0.0516. Based on the above studies, ultra-high pressure treatment is effective for allergen elimination fromLitopenaeus vannamei, but inferior to ultra-high pressure treatment followed by papain hydrolysis and ultra-high pressure treatment in the presence of papain.

Litopenaeus vannamei；ultra-high treatment coupled with papain hydrolysis；allergen elimination；ELISA

TS201.6

1002-6630(2012)03-0068-04

2011-09-30

谢丹丹(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：xddhjj03090512@163.com

*通信作者：胡志和(1962—)，男，教授，硕士，研究方向为专用功能食品。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn