荔枝皮原花青素与VC、VE的协同抗氧化研究

周玮婧，隋 勇，孙智达,*，谢笔钧

(1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070；2.武汉市食品药品检验所，湖北 武汉 430012)

荔枝皮原花青素与VC、VE的协同抗氧化研究

周玮婧1,2，隋 勇1，孙智达1,*，谢笔钧1

(1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070；2.武汉市食品药品检验所，湖北 武汉 430012)

选取荔枝皮原花青素(LPPC)，采用DPPH自由基清除实验与等辐射分析法(Isobologram)相结合，探讨荔枝皮原花青素、VC、VE单独和复配后的抗氧化作用，结果显示：荔枝皮原花青素、VC和VE的IC50值分别为9.98、9.21、27.96mg/L，表明荔枝皮原花青素对DPPH自由基有明显的清除作用。Isobologram分析图中荔枝皮原花青素与VC、VE复配后的效应点都在相加线及95%可信限的下方，理论IC50add值与实验IC50mix值有显著性差异，并且相互作用指数都小于1，证实荔枝皮原花青素与VC，荔枝皮原花青素与VE之间存在协同抗氧化效应。

荔枝皮原花青素；抗氧化；Isobologram分析；协同作用

荔枝为无患子科植物荔枝(Litchi chinensisSoon.)的果实，荔枝皮主要含花色素类、原花色素类、挥发性成分、脂肪族化合物及多种营养成分，主要药效有降糖、降血脂作用，很有开发价值[1]。复合抗氧化剂相比于单一抗氧化剂抗氧化活性高、成本低，以及可避免抗氧化剂的过多使用可能带来的安全问题，有很好的应用前景[2]。等辐射分析法(Isobologram)多用于药物相互作用的研究，基于两种能产生类似效应的药物，在等辐射图中来分析它们之间的相互作用[3]。本课题主要利用荔枝副产物荔枝皮，主要是荔枝皮中含有的丰富原花青素，来研究其抗氧化性，及其与VC、VE的协同抗氧化作用，为复合抗氧化剂的研究提供理论参考。对荔枝副产物加以利用不仅可以提高农民收入，还可以变废为宝，取得良好的经济效益和社会效益。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荔枝品种为妃子笑(Litchi chinensisSonn. cv.Feizixiao)，采自广州市，成熟后采收并立即运回实验室冷藏。

AB-8大孔吸附树脂 南开大学化工厂；DPPH自由基 美国Sigma公司；VC、VE 中国医药集团上海化学试剂有限公司；甲醇、乙醇和硫酸均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FuheHH-4数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；DS-1高速组织捣碎机 上海标本模型厂；SH2-Ⅲ型循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂；X-1001型旋转蒸发器 上海爱朗仪器有限公司；UV-9100紫外-可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 荔枝皮原花青素(LPPC)提取方法

取一定量预先准备的荔枝果皮，用80%乙醇溶液按照料液比1∶20(m/V)混合均匀，50℃恒温水浴锅中提取120min，收集滤液进行真空抽滤，得到样品粗提液。滤液过树脂吸附柱AB-8，用水洗下不被吸附的杂质，用含80%乙醇冲洗树脂吸附柱，收集乙醇洗脱液后减压蒸馏得到的浓缩液，经冷冻干燥后，得到荔枝皮原花青素的样品粉末，纯度为87.45%[4]。

1.3.2 荔枝皮原花青素清除DPPH自由基的IC50值及清除率的计算

DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的自由基，通过在515nm波长处检测荔枝皮原花青素对DPPH自由基的清除效果，计算其抗氧化能力，并计算出自由基清除率为50%时的自由基清除剂的质量浓度，即IC50为半数抑制率质量浓度。取不同稀释度的提取液2mL和2×10-4mol/L的DPPH自由基甲醇溶液2mL，加入同一具塞试管中，摇匀，在室温避光反应30min后于515nm波长处测其吸光度，空白组以等体积无水乙醇代替DPPH自由基溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液，计算荔枝皮原花青素、VC和VE对DPPH自由基的清除率[5]。

式中：A0为对照组吸光度；Ai为样品组吸光度；Aj为空白组吸光度。

1.3.3 Isobologram分析法研究荔枝皮原花青素与VC、VE的相互作用

以VC和VE单独作用的IC50值的比值作为参考，选择荔枝皮原花青素和VC的固定比(质量浓度比)例定为3∶1、1∶1、1∶3，荔枝皮原花青素和VE的固定比例定为1∶1、1∶3、1∶9，按固定比例混合后，以同样的方法测定复合抗氧化剂对DPPH自由基的清除作用，计算清除率及复合组的IC50值。

1.3.4 统计学分析

固定比例法除了从Isobologram图做直观判断外，还可以进行统计学分析。首先计算理论上的复配组IC50add值。

式中：R为A、B两种抗氧化剂单独应用时的效价比，即R=IC50A/IC50B；P1为抗氧化剂A在复配组中所占的比例；P2为抗氧化剂B在复配组中所占的比例，P2=1－P1。由实验可以得到复配组实际的IC50mix值，采用t检验对理论上的IC50add和实验得到的IC50mix进行统计比较，确定是否有显著性差异，若IC50mix值小于IC50add值，表示相互作用为协同作用[6-7]。

再计算相互作用指数(γ)，常用其来评价协同或拮抗作用的程度。

IC50Amix、IC50Bmix分别为复配组中A、B两种抗氧化剂的IC50值；IC50A、IC50B分别为A、B两种抗氧化剂单独作用时的IC50值。若γ=1，表示相互作用为相加；若γ＜1，表示相互作用为协同作用，γ值越小说明协同作用越强；若γ＞1，表示相互作用为拮抗作用[8]。

2 结果与分析

2.1 荔枝皮原花青素、VC、VE清除DPPH自由基能力的比较

图1 不同抗氧化剂清除DPPH自由基的能力Fig.1 DPPH radical scavenging capacity of different antioxidants

由图1可知，荔枝皮原花青素、VC、VE都有清除DPPH自由基的能力，随着质量浓度的增加，清除率也逐渐增加，且当质量浓度达到一定数值后，清除率趋于稳定。当荔枝皮原花青素的质量浓度达到20mg/L时，可达到90%以上的清除率。荔枝皮原花青素、VC、VE的IC50值分别为9.98、9.21、27.96mg/L，清除DPPH自由基的能力依次为VC＞荔枝皮原花青素＞VE，表明荔枝皮原花青素有较强的清除自由基能力，即抗氧化活性较高。

2.2 Isobologram分析法评价荔枝皮原花青素与VC、VE的相互作用

2.2.1 荔枝皮原花青素与VC、VE复配后清除DPPH自由基能力的测定

从荔枝皮原花青素、VC、VE清除DPPH自由基的实验中可以得到，荔枝皮原花青素与VC 的IC50值比率为1∶0.92，荔枝皮原花青素与VE的IC50值比率为1∶2.80。选择3组固定比例，荔枝皮原花青素和VC的固定比例定为3∶1、1∶1、1∶3，荔枝皮原花青素和VE的固定比例定为1∶1、1∶3、1∶9，每组固定比例中的质量浓度选择应在10～100g/100mL范围内均匀分布为宜。按固定比例混合后，以同样的方法测定复合抗氧化剂对DPPH自由基的清除作用(表1)；由表1计算出荔枝皮原花青素与VC、VE组成的复配抗氧化剂对DPPH自由基的清除作用的 IC50值(表 2)。

表2 LPPC与VC、VE复配后清除DPPH自由基的IC50值Table 2 IC50 of LPPC combined with VC or VE against DPPH radicals

2.2.2 荔枝皮原花青素与VC、VE复配后的 Isobologram分析图

根据(表2)所测得的IC50值标绘在Isobologram分析图上(图2)，将DPPH自由基清除实验中得到的荔枝皮原花青素IC50值和95%可信限标绘在横轴上，VC和VE的IC50值和95%可信限标绘在纵轴上，将两IC50值相连后构成相加线，将两可信限分别相连后作出相加线95%可信限。如果复合原花青素效应(复配点IC50)落在相加效应线上或可信限内，则表示两药作用为相加；如落在相加效应线的可信限左侧，则代表协同作用；如落于右侧，则为拮抗作用[9]。由图2可知，复配组的效应点均落在相加线和95%可信限的下方(左侧)，表明荔枝皮原花青素与VC、VE复配后有协同抗氧化作用。

图2 LPPC和VC、VE复配的Isobologram分析图Fig.2 Isobolographic plot of LPPC combined with VC or VE

表1 LPPC与VC、VE复配后清除DPPH自由基的能力Table 1 DPPH radical scavenging capacity of LPPC combined with VC or VE

2.2.3 统计学分析

按1.3.4节所述方法及相应公式计算复配组理论上的IC50add值和相互作用指数γ，对理论IC50add值和实验IC50mix值在95%置信区间进行t检验，结果见表3。

表3 荔枝皮原花青素与VC、VE复配后的统计学分析结果Table 3 Antioxidant effects of LPPC combined with VC or VE

由表3可出，各种组合的IC50mix值均小于IC50add值，经过t检验证明两者之间有显著性差异，且相互作用指数γ都小于1，表明荔枝皮原花青素与VC、VE的相互作用是协同作用。γ值越小说明协同作用越强，由此可得荔枝皮原花青素与VE复配组的协同作用比荔枝皮原花青素与VC复配组更为显著，尤其是1∶1和1∶3配比的协同作用更好，荔枝皮原花青素与VE复配组中协同作用的强弱顺序为1∶1＞1∶3＞1∶9，荔枝皮原花青素与VC复配组中协同作用的强弱顺序为1∶1＞3∶1＞1∶3。

3 结 论

Isobologram分析法是国外常用于判断药物之间相互作用的方法，被看作是评价药物相互作用的“黄金标准”[10]。Isobologram分析法能简单有效地评价抗氧化剂之间的相互作用，相互作用指数能为抗氧化剂的最佳配比提供理论依据[11]。本实验主要从研究方法学角度进行了探索，采用将DPPH自由基清除实验与Isobologram分析法相结合，比较了荔枝皮原花青素和VC、VE添加比例对其相互作用的影响，结果显示，复配后有协同抗氧化作用，按不同比例进行复配得到的协同抗氧化作用程度存在明显差异，且荔枝皮原花青素与VE复配组的协同作用强于荔枝皮原花青素与VC复配组。这将为复合抗氧化剂的使用提供参考依据。不过复合抗氧化剂的最佳配比还需根据相互作用指数进一步探究和确定，从而优化复配方案，减少抗氧化剂的用量、节约成本，更好地指导生产实践。荔枝皮原花青素与VC、VE协同作用的机理还不清楚，有待进一步研究。

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Synergistic Antioxidant Effects of Procyanidins fromLitchi chinensisPericarp and VC or VE

ZHOU Wei-jing1,2，SUI Yong1，SUN Zhi-da1,* ，XIE Bi-jun1
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China；2.Wuhan Institute for Food and Drug Control, Wuhan 430012, China)

In order to explore the synergistic antioxidant effects of procyanidins fromLitchi chinensispericarp (LPPC) and vitamin C (VC) or vitamin E (VE), the antioxidant capacity of LPPC in the presence of VC or VE was evaluated by DPPH radical scavenging assay coupled with isobologram method. The results indicated that the IC50 of LPPC, VC and VE were 9.98, 9.21mg/L,and 27.96 mg/L, respectively, which suggested that LPPC had significant DPPH radical scavenging effect. The effect-response points of LPPC combined with VC or VE were observed below the addition line with 95% confidence interval in isobolographic plots. Meanwhile, a significant difference between theoretical IC50add value and experimental IC50mix value was achieved. The interaction index of each combination was less than 1. These findings indicate that there is a synergistic antioxidant effect between LPPC and VC or VE, which will reveals promising prospects in practical applications.

procyanidins fromLitchi chinensispericarp (LPPC)；antioxidation；isobologram；synergistic effect

TS201.1

A

1002-6630(2012)03-0005-04

2011-03-19

国家自然科学基金-广东省联合基金项目(U0731005)

周玮婧(1985—)，女，硕士，研究方向为天然产物化学。E-mail：elfinlife221@163.com

*通信作者：孙智达(1962—)，男，教授，博士，研究方向为天然产物化学。E-mail：sunzhida@sina.com