APP下载

瑞香狼毒水提取物对人膀胱癌T24细胞Survivin表达的影响

2012-10-17李建文张雁钢

中国医药导报 2012年10期
关键词:瑞香狼毒膀胱癌

申 彦 李建文 张雁钢

1.山西医科大学,山西太原 030001;2.山西医学科学院山西大医院泌尿外科,山西太原 030001

膀胱肿瘤是泌尿系肿瘤中最常见的肿瘤,多数为移行上皮细胞癌,国外膀胱肿瘤的发病率在男性泌尿生殖器肿瘤中仅次于前列腺癌,居第2位,在国内则占首位。随着对生存素(Survivin)基因的研究深入,发现Survivin基因作为一种凋亡抑制基因在膀胱癌发生、发展过程中起着重要的作用,且与肿瘤的分级、分期密切相关。本研究应用中药瑞香狼毒水提取物作用于人膀胱癌T24细胞,探讨瑞香狼毒对膀胱癌T24细胞生物学行为的影响,以期为临床开辟新治疗途径提供理论依据。现将结果报道如下:

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 来源 人膀胱癌T24细胞株由山西医科大学寄生虫实验中心提供。瑞香狼毒购自山西省医药公司,山西医科大学药物学院进行药物提取。

1.1.2 主要试剂 RPMI-1640为赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司产品;胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产;二甲基亚砜(DMSO)为天津市科密欧化学试剂开发中心产品;丝裂霉素为日本协和发酵工业株式会社富士工厂产品;兔抗人Survivin单克隆抗体(工作液)为中杉金桥公司产品。

1.1.3 主要设备 超净工作台,相差倒置显微镜,二氧化碳恒温培养箱,水浴箱,水平离心机,全自动ELX800酶联免疫分析仪,流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将膀胱癌T24细胞复苏后接种至培养瓶,加含有10%胎牛血清和双抗的RPMI-1640培养基5 mL瓶盖微松,放置37℃,5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中,每2~3天更换培养液,待细胞生长至贴满培养瓶壁时,用0.25%胰酶消化传代。

1.2.2 MTT法检测膀胱癌T24细胞抑制率 将细胞消化、计数,将其接种至96孔培养板中,每孔5×104个细胞,容积100 μL,置CO2培养箱中继续培养12 h细胞贴壁后,于96孔板中依次加入不同浓度的瑞香狼毒水提取物(0.04、0.2、1、5 g/mL)每一浓度设6个复孔,同时设一个空白组(仅加入100 μL RPMI-1640培养基)和对照组(未加药物的100 μL细胞悬液)。继续培养 12、24、48、72 h 后, 每孔加入 MTT 试剂 20 μL,置CO2培养箱中继续培养4 h后弃上清,每孔加二甲基亚砜100 μL置摇床上混匀,10 min后用酶标仪在490 nm发射波长下读OD数值,计算细胞抑制率。抑制率的计算:抑制率=(1-OD处理组/OD对照组)×100%。

1.2.3 细胞凋亡率的检测 将对数生长期的膀胱癌T24细胞消化、计数,种植于6孔板内,每孔1×106个细胞,容积3 mL。待12 h细胞附壁后加入不同浓度药物。实验分为对照组(未加药物的 100 μL 细胞悬液),药物组(0.04、0.2、1、5 g/mL)每组设5个复孔,作用48 h后收集细胞,Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂进行染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 免疫细胞化学 取对数生长期膀胱癌T24细胞,消化、计数,种植于6孔板内,每孔1×105个细胞,容积3 mL。12 h细胞附壁后加药干预,实验分为对照组(未加药物的100 μL细胞悬液),药物组(0.04、0.2、1、5 g/mL)每组设 5 个复孔,作用48 h后进行免疫细胞化学染色,加入兔抗人Survivin单克隆抗体工作液,4℃温箱孵育过夜,次日滴加二抗(羊抗兔)、显色剂,封片后观察细胞Survivin蛋白的表达。实验以细胞胞浆或细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性结果,在显微镜下拍照并行灰度值测定。

1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析,多个样本均数间两两比较采用Bonferroni法检验,计量资料采用均数±标准差(±s)表示,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测结果

瑞香狼毒水提取物对膀胱癌T24细胞的生长抑制作用通过MTT法检测不同浓度药物分别处理12、24、48、72 h后,测各组细胞吸光度(表1)及抑制率(表2),结果显示瑞香狼毒水提取物对该细胞株有明显的生长抑制作用,浓度越高作用,时间越长,抑制作用越明显。

表1 不同浓度瑞香狼毒水提取物对膀胱癌T24细胞作用的OD值(±s)

表1 不同浓度瑞香狼毒水提取物对膀胱癌T24细胞作用的OD值(±s)

注:与对照组比较,★P<0.05;每个药物浓度组与前一药物浓度组比较,△P<0.05;每个时间段与前一时间段比较,○P<0.05

药物浓度(g/mL)OD值12 h 24 h 48 h 72 h对照组0.04 0.2 15 0.69±0.03 0.61±0.03★0.56±0.07★0.40±0.02★△0.32±0.05★△0.73±0.04 0.57±0.03★0.43±0.02★△○0.37±0.06★0.28±0.03★△0.76±0.04 0.53±0.05★0.38±0.03★△○0.30±0.05★△○0.22±0.05★△○0.82±0.04 0.46±0.05★○0.28±0.05★△○0.23±0.05★○0.15±0.02★△○

2.2 凋亡率检测结果

药物组(0.04、0.2、1、5 g/mL)分别作用于膀胱癌 T24 细胞 48 h 后,细胞凋亡率分别为(11.67±2.61)%、(22.40±3.18)%、(38.29±2.30)%、(57.57±3.77)%,各组与对照组凋亡率[(1.05±0.34)%]比较差异有统计学意义(P<0.05),高浓度组与低浓度组比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。结果显示,随着药物浓度的增高,膀胱癌T24细胞的凋亡率增加。

表2 不同浓度瑞香狼毒水提取物对膀胱癌T24细胞增殖抑制率(±s,%)

表2 不同浓度瑞香狼毒水提取物对膀胱癌T24细胞增殖抑制率(±s,%)

注:每个浓度组与前一浓度组比较,▲P<0.05;每个时间段与前一时间段比较,◇P<0.05

药物浓度(g/mL)抑制率12 h 24 h 48 h 72 h 0.04 0.2 15 12.49±4.09 19.10±9.68 42.33±3.52▲54.55±6.77▲21.99±4.48◇41.40±3.22▲◇48.86±7.65 61.16±4.48▲30.00±6.44 50.01±3.31▲60.74±6.64▲◇71.58±6.03▲◇44.72±5.67◇65.70±6.23▲◇71.58±5.84◇81.59±2.26▲◇

2.3 免疫细胞化学结果

药物组(0.04、0.2、1、5 g/mL)分别作用于膀胱癌 T24 细胞48 h后,经过免疫细胞化学染色、封片、显微镜下拍照后,测各组灰度值分别为(142.49±1.67)、(152.14±2.66)、(161.63±4.44)、(171.72±1.17),各组与对照组灰度值(130.84±4.99)比较,差异有统计学意义(P<0.05),高浓度组与低浓度组比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。结果显示,瑞香狼毒水提取物作用于膀胱癌T24细胞后,下调细胞中Survivn蛋白表达,浓度越高,下调作用愈明显。

3 讨论

瑞香狼毒为瑞香科狼毒属植物,又名红狼毒、棉大戟、断肠草等,为中药狼毒之正品,有毒,用药部位为根,性味苦平,有逐水祛痰、破积杀虫之功效。现代药理学研究发现具有抗肿瘤、抗病毒、调节免疫等活性[1]。国外膀胱癌的发病率在男性泌尿生殖肿瘤中仅次于前列腺癌,在我国则占首位。目前,国内外采用综合治疗措施,药物治疗在其中发挥重要作用。国内外学者在瑞香狼毒对肺癌、肝癌、宫颈癌等恶性肿瘤的研究中取得一定成果[2-4],但对泌尿系统如膀胱癌细胞的抗肿瘤研究少有报道。Survivin是近年发现的细胞凋亡抑制因子,具有高度保守性和明显抵抗细胞凋亡的作用,参与调控细胞分裂、增殖等过程[5]。Survivin在除胸腺外正常组织中不表达,而在大部分肿瘤细胞中高表达[6]。Survivin基因作为一种凋亡抑制基因在膀胱癌发生、发展过程中起着重要的作用[7-8],其表达情况与肿瘤的分级、分期密切相关[9-10],可以作为膀胱癌早期诊断及判断预后的检查指标[11]。本实验研究选择人膀胱癌T24细胞株,给予膀胱癌T24细胞不同浓度瑞香狼毒处理后,观察细胞的抑制率、凋亡率以及Survivin蛋白表达的情况。结果显示:瑞香狼毒水提取物对膀胱癌T24细胞具有明显的抑制作用,具有浓度和时间依赖性。研究结果还发现瑞香狼毒水提取物促进膀胱癌T24细胞凋亡并下调Survivin蛋白的表达。

综上所述,瑞香狼毒水提取物可诱导膀胱癌细胞发生凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,其作用机制可能与Survivin蛋白表达的下调有关。由于药物促使肿瘤细胞凋亡是通过多条途径共同作用的结果,因此需要进一步深入研究,为开辟膀胱癌临床治疗新途径提供理论依据。

[1]罗慧英,王爱勤.不同极性溶媒瑞香狼毒提取物的抗肿瘤活性比较[J].中国临床药理学与治疗学,2005,10(10):1140-1141.

[2]Yoshida M,Yokokura H,Hidaka H,et al.Mechanism of antitum or action of PKC activator,gnidimacrin[J].Int J Cancer,1998,77(2):243-252.

[3]冯威健,池川哲郎,吉田光二.瑞香狼毒提取物尼地吗啉的抗癌活性[J].中华肿瘤杂志,1995,17(1):24-29.

[4]Yoshida M,Feng WJ,Saijo N,et al.Antitum or activity of daphnanetype diterpene gnidimacrin isolated from Stellera chamaejasme L [J].Int J Cancer,1996,66(2):268-278.

[5]Ambrosini G,Adida C,Altieri DC.Anovel antiapoptosis gene,survivin,expressed in cancer and lymphoma[J].Nat Med,1997,3(8):917-921.

[6]Hoffman WH,Biade S,Zilfou JT,et al.Transcriptional repression of the anti-apoptotic survivin gene by wild type p53 [J].J Biol Chem,2002,277(5):3247-3257.

[7]Kitsukawa S,Aoyagi T,Noda K,et al.Quantitative analysis of survivin mRNA expression in bladder transitional cell carcinomas[J].Hinyokika Kiyo,2008,54(2):101-106.

[8]Kitamura H,Torigoe T,Honma I,et al.Expression and antigenicity of survivin,an inhibitor of apoptosis family member,in bladder cancer:implications for specific immunotherapy[J].Urology,2006,67(5):955-959.

[9]Karam JA,Lotan Y,Ashfaq R,et al.Survivin expression in patients with non-muscle invasive urothelial cell carcinoma of the bladder[J].Urology,2007,70(3):482-486.

[10]Swana HS,Grossman D,Anthony JN,et al.Tumor content of the anti apoptosis molecule survivin and recurrence of bladder cancer [J].N Engl J Med,1999,341(6):452-453.

[11]Schultz IJ,Kiemeney LA,Karthaus HF,et al.Survivin mRNA copy number in bladder washings predicts tumor recurrence in patients with superficial urothelial cell carcinomas [J].Clin Chem,2004,50(8):1425-1428.

猜你喜欢

瑞香狼毒膀胱癌
火星第一株狼毒花发芽啦
苹果新品种“瑞香红”通过国家林木品种审定
VI-RADS评分对膀胱癌精准治疗的价值
瑞香
狼毒净和灭狼毒对青海省草地狼毒的防治效果
Analysis of compatibility rules and mechanisms of traditional Chinese medicine for preventing and treating postoperative recurrence of bladder cancer
The Introduction to application of color in Chen Dan
UPLC法同时测定狼毒大戟中岩大戟内酯A和B
散结杀虫的狼毒
瑞香素药理作用的研究进展