趋化生长因子受体4和基质金属蛋白酶-13在喉鳞状细胞癌中的表达及临床意义的研究

郭梦媛 皇甫辉 王丹丹 韩 瑞 李 卓 赵 轶

山西医科大学第一临床附属医院耳鼻咽喉科，山西太原 030000

喉鳞状细胞癌是呼吸道最常见的恶性肿瘤之一，大量研究显示趋化生长因子受体4（CXCR4）在某些肿瘤组织中有着过量的表达，通过SDF-1/CXCR反应轴控制肿瘤细胞迁徙和靶器官特异性表达[1-2]。而基质金属蛋白酶-13（MMP-13）在趋化因子生物轴的下游激活途径中有其结合位点，从而促进磷酸化，使作用增强[3]。本文研究采用免疫组织化学方法和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测CXCR4和MMP-13的蛋白及mRNA在喉鳞状细胞癌及其正常黏膜组织中的表达情况，探讨CXCR4和MMP-13在喉癌淋巴结转移中的作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料

免疫组化方法选择我院耳鼻喉科2009年10月～2011年9月喉鳞癌切除后存档的蜡块，共70例，患者年龄为34～76岁，平均（56.7±6.7）岁，其中男 60 例，女 10 例；RT-PCR 方法选择2010年7月～2011年9月喉鳞癌切除后的新鲜组织，共 30 例，患者年龄为 36～72 岁，平均（55.9±6.2）岁，其中男25例，女5例。以上临床资料均完整，患者术前未接受放化疗。收集10例癌旁正常喉黏膜的新鲜组织做为对照组，一部分石蜡包埋用于免疫组化，另一部分置于灭菌的锡箔纸内，投入液氮罐内，随后放入深低温（-86℃）冰箱中保存，用于RT-PCR技术实验用。

1.2 免疫组织化学方法

CXCR4和MMP-13均以兔抗人多克隆抗体（武汉博士德生物技术有限责任公司）。实验严格按照试剂盒说明书操作。结果均由两位病理主治医师共同阅片得出。CXCR4和MMP-13蛋白均以细胞浆呈有棕黄色颗粒为阳性，每张切片观察5个具有代表性的高倍镜视野，根据染色部位的染色强度和染色细胞百分率进行评分：基本不着色为0分，着色淡者为1分，着色深者为2分；着色细胞占计数细胞百分率＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分。将每张切片的着色强度得分和着色细胞百分率得分相乘，为其最后得分。0～1分为阴性（-），≥2分为阳性。

1.3 RT-PCR方法

采用Trizol试剂提取总RNA，引物设计应用primer 5.0软件，序列及合成的产物大小为：CXCR4上游：5′-CGGAA TTCCAGCAGGTAGCAAAGTGACG-3′，下游：5′-GACGCCAAC ATAGACCACCT-3′；扩增长度为 561 bp；MMP-13 上游：5′-GACTTCACGATGGCATTGCTG-3′，下游：5′-GCATCAACCTGCTGAGGATGC-3′；扩增长度为491 bp；以GAPDH为内参对照。 反应体系均为 94℃ 3 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃90 s 35个循环，72℃5 min；产物以1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，照相并分析。

1.4 统计学方法

应用SAS 6.12进行数据的分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用百分率表示，组间对比采用χ2检验，并进行线性相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果

2.1.1 CXCR4及MMP-13在喉鳞癌与正常黏膜中的表达 由表1可见，CXCR4及MMP-13在喉鳞癌中表达的阳性率明显高于正常黏膜组织。CXCR4和MMP-13在喉鳞状细胞癌中表达于肿瘤细胞的细胞质及细胞膜，呈阳性或强阳性，而在正常喉黏膜上皮细胞中呈弱阳性或阴性，见图1～4。

图1 CXCR4在正常组织中的表达（免疫组化，×200）

图2 CXCR4在癌组织中表达（免疫组化，×200）

2.1.2 喉鳞癌中CXCR4及MMP-13在不同临床病理特征的表达 由表2可见，喉鳞癌CXCR4蛋白的表达与肿瘤的分期、分化程度及淋巴结转移有关，喉鳞癌MMP-13蛋白的表达与肿瘤的分化程度及淋巴结转移有关（P＜0.05），CXCR4及MMP-13均与年龄和性别无关。

图3 MMP-13在正常组织中的表达（免疫组化，×200）

图4 MMP-13在癌组织中表达（免疫组化，×200）

2.1.3 喉鳞癌中CXCR4及MMP-13蛋白表达的相关性分析 对喉鳞癌中CXCR4及MMP-13蛋白的表达进行相关性分析，结果显示二者呈正相关（r=0.45，P＝0.012 5）。

2.2 RT-PCR结果

2.2.1 CXCR4与MMP-13在喉鳞癌组与正常黏膜组中mRNA的表达 CXCR4 为（1.25±0.28）、（0.55±0.19），鳞癌组与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；喉鳞癌组与正常黏膜组中MMP-13 mRNA 的表达分别为（1.10±0.21）、（0.04±0.01），差异有统计学意义（P＜0.05）。CXCR4及MMP-13在喉鳞癌和正常黏膜中mRNA表达情况经逆转录PCR扩增条带结果，见图 5～6。

2.2.2 喉鳞癌中CXCR4和MMP-13 mRNA在不同临床病理特征中的表达 喉鳞癌CXCR4和MMP-13 mRNA的表达量与肿瘤的分化程度及淋巴结转移有关（P＜0.05）。见表3。

表3 喉鳞癌中趋化生长因子受体4及基质金属蛋白酶-13 mRNA在不同临床病理特征的表达（±s）

表3 喉鳞癌中趋化生长因子受体4及基质金属蛋白酶-13 mRNA在不同临床病理特征的表达（±s）

临床病理特征 例数 CXCR4 t值 P值 MMP-13 t值 P值分化程度高、中分化低分化淋巴结转移13 17 0.99±0.26 1.45±0.25 6.570.026 30.85±0.21 1.29±0.20 6.020.028 4无有16 14 1.09±0.24 1.43±0.22 5.760.034 20.94±0.23 1.28±0.19 5.780.034 0

2.2.3 喉鳞癌中CXCR4及MMP-13 mRNA表达的关系 经线性相关分析，喉鳞癌中CXCR4及MMP-13 mRNA的表达呈正相关（r=0.42，P ＝ 0.027 5）。

3 讨论

肿瘤的生长与扩散是重要的生物学行为，而蔓延与远处转移是恶性肿瘤细胞和细胞外基质成分共同参与的一个复杂而有序的过程，细胞外基质的降解及肿瘤细胞的转移是必不可少的过程。CXCR4是一类表达于不同细胞上含有7个跨膜区的G蛋白偶联受体，SDF-1是CXCR4的唯一配体，研究显示某些肿瘤组织CXCR4有着过量的表达，控制白细胞对肿瘤的浸润，调节肿瘤血管生成，激活宿主对肿瘤细胞的特异性免疫应答，以自分泌或旁分泌的方式刺激肿瘤细胞的增殖，通过SDF-1/CXCR4反应轴控制肿瘤细胞迁徙和靶器官特异性表达[4]。SDF-1/CXCR4生物学轴的活动表现为细胞内储备钙的调动及MAPK（丝裂原结合蛋白酶）的活化，伴其下游信号分子的磷酸化[5]。肿瘤发生发展是一个多步骤、多基因调控的复杂过程，癌细胞从原发病灶脱落后，需突破细胞外基质和基底膜组成的结构屏障，才能向周围组织侵袭或进入脉管中，引发转移[6-7]，在此过程中，起作用的有基质金属蛋白酶家族。CXCR4在肿瘤发展过程中可以引起MMPs的磷酸化，使肿瘤细胞分泌更多的MMPs。MMP-13是基质金属蛋白酶家庭的重要成员，是1994年首先从人类乳腺癌细胞中分离出来的，在MMPs激活过程中起关键作用，可激活其他亚型的MMPs，在肿瘤侵袭和转移中具有重要作用[8-9]。如MMP-13在激活其他MMP的过程中还具有催化自身的作用，可促进活性MMP-9的产生，在此过程中MMP-13处于中心地位[10]，MMP-13水平的微小改变或活性的增强，都可能放大整个下游的蛋白分解作用，从而降解细胞外基质和基底膜对组织产生破坏。

表1 趋化生长因子受体4及基质金属蛋白酶-13在喉鳞癌与正常喉黏膜中的表达[n（%）]

表2 趋化生长因子受体4及基质金属蛋白酶-13的表达与喉鳞癌临床病理特征的关系[n（%）]

图5 CXCR4基因在不同喉组别中的表达

图6 MMP-13基因在不同喉组别中的表达

本实验通过采用免疫组织化学方法和RT-PCR方法检测喉鳞癌组织及癌旁正常黏膜组织中CXCR4及MMP-13蛋白和mRNA的表达，免疫组织化学检测结果显示CXCR4及MMP-13在喉鳞癌组织中的蛋白表达率分别为71.43%和74.29%，明显高于正常黏膜组（P＜0.01）。结果还表明，CXCR4蛋白表达水平与肿瘤分期、分化程度及淋巴结转移有关，MMP-13蛋白表达水平与肿瘤分化程度及淋巴结转移有关，但与肿瘤分期无关，本研究结果的出现可能与病例选择或例数较少有关。二者蛋白表达均与肿瘤的分化程度及淋巴结转移密切相关（P＜0.05），与患者年龄、性别无关，提示CXCR4和MMP-13可能在喉癌的形成和发展过程中有一定的作用，与喉癌淋巴结的侵袭和转移有关。并通过Rt-PCR结果显示，CXCR4和MMP-13在喉癌组织中mRNA表达明显高于癌旁正常黏膜（P＜0.05），在分化程度及淋巴结转移中表达水平有统计学意义（P<0.05），这一结果与免疫组化结果相一致，由于分化程度与淋巴结转移均与患者的预后相关，因此CXCR4及MMP-13蛋白和mRNA可能有助于判断患者的预后，即CXCR4及MMP-13蛋白和mRNA高表达患者的预后差，进而通过检测两者的表达来预测喉癌的早期转移和复发。

本研究还通过对CXCR4和MMP-13蛋白的表达进行相关性分析，二者呈正相关（r=0.45，P=0.012 5），同时，CXCR4和MMP-13 mRNA表达的相关分析与蛋白表达相同（r=0.42，P=0.027 5）。说明在喉鳞癌中CXCR4及MMP-13在蛋白和mRNA水平上都具有协同正向作用，提示二者在喉鳞癌的发生发展中具有明显的促进作用。

综上所述，喉鳞癌组织中CXCR4和MMP-13在蛋白水平及mRNA水平均升高，二者共同促进肿瘤的发生发展，可通过术后联合检测CXCR4及MMP-13蛋白和mRNA的表达来评估喉癌的浸润转移、术后复发等，有可能对判断预后有一定价值。

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