转cry1Ac+cry2Ab基因棉与转cry1Ac+EPSPS基因棉荒地的生存竞争能力

张兴华，田绍仁，张天玉，李 捷，乔艳艳

江西省棉花研究所，江西九江332105

苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis δ-内毒素晶体蛋白基因简称 Bt基因(Crickmore et al.，1998)，是世界上应用最广泛的生物杀虫剂(关雄，2006)。据统计，已报道的 Bt基因有60种以上。根据它们的杀虫范围和基因序列差异，可大致分为6 类，即 cry1、cry2、cry3、cry4、cry5、cryt。每一类中又包含不同的亚类，前5类称为晶体蛋白基因家族，第6类称为细胞外溶性晶体蛋白基因(张洪瑞等，2008)。1981年Shnepf＆Witeleg首次从苏云金芽孢杆菌中分离并克隆了Bt基因，美国孟山都公司将Bt基因经过启动子改造后转入棉花中，于1995年获得了2种转Bt基因抗虫棉NUCOTN33B和NUCOTN35B(谢德意，2001)。我国于1990年从苏云金芽孢杆菌亚种aizawai7-29和KurstakiHD-1中分离克隆了Bt基因(谢道昕和范云六，1991);后对其进行改造并获得具有自主知识产权的抗虫性极强的 Bt基因［GFM cry1A BT基因(cry1Ab、cry1Ac)］(郭三堆，1993;郭三堆等，1993)，且由中国农业科学院生物工程中心、中国农业科学院棉花研究所等单位将改造的Bt基因转入国产棉花品种中，于1994年成功获得了第一批国产转单价Bt基因抗虫棉(张锐等，2007)。1998年孟山都公司将腈水解酶基因BXN与Bt基因同时转入一个棉花中，获得既抗虫又抗溴苯腈除草剂的棉花品种(冯坚，2006)。

近几年，我国又推出了转双价Bt和豇豆胰蛋白酶抑制抗虫基因(cry1Ac+CPTI)棉(Wu＆Guo，2005)、转双价双Bt抗虫基因(cry1Ac+cry2Ab)棉(雒珺瑜等，2011)、转双价抗虫和抗除草剂基因(cry1Ac+EPSPS)棉、转双价抗病基因(Chi+Glu)棉等新品种。对于这些新的转基因棉花品种，必须在推广种植前进行环境安全风险评估。我国仅在2007年公布了1项技术标准，即农业部953号公告-12-2007(以下简称953号公告)。但该标准仅适用于转单价Bt基因抗虫棉，一些新的转双价复合基因棉仍缺乏环境安全评价技术标准。为此，中华人民共和国农业部从“十一五”起开始设立环境安全评价技术研究专项。本文对转cry1Ac+cry2Ab基因棉与转cry1Ac+EPSPS基因棉荒地的生存竞争能力进行研究，以期为转双价双Bt抗虫基因棉和转双价抗虫、抗除草剂基因棉环境安全评价技术的建立提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验品种:转双价双Bt抗虫基因(cry1Ac+cry2Ab)棉，转双价抗虫、抗除草剂基因(cry1Ac+EPSPS)棉均由中国农业科学院棉花研究所提供;对照品种:非转基因常规棉——赣棉11号为江西省棉花研究所研制品种。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 试验地设在江西省棉花研究所内，面积40 m×6 m。试验品种和对照品种各设4个重复，随机排列，每个重复的小区面积为3 m×2 m，播40粒棉种，分地表撒播和3 cm深度点播2种方式。播种后不进行任何栽培管理。

1.2.2 调查内容 试验期间调查优势杂草种类、高度和覆盖度(目测各种杂草占小区的比例)，棉花出苗数、株高、生育进程(蕾、铃、吐絮)、吐絮瓣数、吐絮瓣脱落率、自生苗等指标。

1.2.3 调查时间 于2011年5月4日播种前调查各小区杂草种类、高度和覆盖度，6月5日播种后30 d开始第1次调查，以后每隔1个月调查1次，至11月上旬结束。2012年3月底进行第2次吐絮棉瓣脱落率和自生苗调查。

1.2.4 数据处理 将试验数据进行方差分析、LSD最小显著性极差检验。其中，由于吐絮瓣数和絮瓣脱落率各有1～2个小区数据为0，无法进行生物统计上的差异显著性分析。鉴于此，作者应用普通方法进行统计，自定差异显著性标准:＜5%为差异不显著，5% ～10%为差异显著，＞10%为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 地表撒播竞争能力表现

2.1.1 播种前杂草情况 播种前，试验地杂草平均覆盖度95.4%，平均高度10～70 cm。其中，优势杂草5种:野麦Avena fatua L.、南苜蓿Medicago hispida Gaertn.、野芹菜 Sanicula lamelligera Hance、风花菜Rorippaislandica(Oed.)Borb.、猪殃殃 Galium aparine L.var.tenerum(Gren.Et Godr.)Rcbb.;非优势杂草4种:野老鹳草Geranium carolinianum L.、一年蓬 Erigeron annuus(L.)Pers.、刺儿菜 Cephalanoplos segetum(Bge.)Kitam.、小飞蓬 Conyza canadensis(L.)Cronq.;其他杂草数量稀少(表1)。

表1 播种前杂草种类、高度及覆盖度Table 1 The species，height and coverage of weed before sowing

2.1.2 出苗竞争力 6月 5日和 7月5日:转cry1Ac+cry2Ab基因棉各小区杂草平均高度分别为50.0 和57.5 cm，平均覆盖度分别为 88.8%和 97.5%(表2)，平均出苗率分别为 2.5% 和 6.9%(表 3);转cry1Ac+EPSPS基因棉各小区杂草平均高度分别为47.5 和50.0 cm，平均覆盖度分别为87.5%和91.3%(表2)，平均出苗率分别为 2.5% 和 5.0%(表 3)。以上指标与对照相比差异均不显著。这表明转cry1Ac+cry2Ab基因棉和转cry1Ac+EPSPS基因棉在6～7月出苗率竞争优势均较小，棉苗被杂草覆盖。

8月5日和9月5日:转cry1Ac+cry2Ab基因棉各小区杂草平均高度分别为150.0和167.5 cm，平均覆盖度均为100%(表2)，平均出苗率分别为9.4%和10.6%(表3);转 cry1Ac+EPSPS 基因棉各小区杂草平均高度分别为150和175.0 cm，平均覆盖度均为100%(表2)，平均出苗率分别为5.6%和7.5%(表3)。以上指标中，仅9月5日的转cry1Ac+cry2Ab基因棉平均出苗率与对照相比差异显著，其余均不显著。

出苗竞争力方面杂草化风险评估:(1)直到9月份，转cry1Ac+cry2Ab基因棉出苗率与对照相比才表现出显著的竞争优势，此时已是棉花生长末期，失去了成熟的机会，不能繁殖传代，因此不具有杂草化风险;(2)转cry1Ac+EPSPS基因棉出苗率与对照相比始终无显著的竞争优势，也不具有杂草化风险。

表2 2种播种方式下小区杂草高度及覆盖度Table 2 The height and coverage of weed in each district by two sowing methods

表3 2种播种方式下转基因棉的出苗率、株高及生育进程Table 3 The seedling emergence，height and growing process of transgenic cotton by two sowing methods

2.1.3 株高竞争力 在7～11月5个调查日中，转cry1Ac+cry2Ab基因棉平均株高分别为15.00、21.33、36.78、36.80 和 36.85 cm，转 cry1Ac+EPSPS基因棉平均株高分别为 13.75、19.95、28.05、28.13 和29.38 cm，与对照相比差异均不显著(表3)。这表明在整个生长期，转cry1Ac+cry2Ab基因棉和转cry1Ac+EPSPS基因棉与对照相比，株高竞争优势均较弱;与同期杂草(表2)相比，株高也处于劣势，出苗稀少，一直处于杂草的覆盖下，生长上无竞争力。由此可见，这2种转基因棉在株高竞争力方面均无杂草化风险。

2.1.4 生育进程竞争力 转cry1Ac+cry2Ab基因棉吐絮比对照快1个月(表3)，显示出生育进程竞争优势，具有一定的杂草化风险;转cry1Ac+EPSPS基因棉成铃比对照慢2个月(表3)，在生育进程上无竞争力，且在生长期内，成铃未进入吐絮期由此丧失絮棉种子繁殖的机会，从而在棉生育进程竞争力上不具有杂草化风险。

2.1.5 吐絮瓣和絮瓣脱落竞争力 2011年11月5日，转cry1Ac+cry2Ab基因棉和转cry1Ac+EPSPS基因棉平均吐絮瓣数分别为1.5和0个，与对照相比差异均不显著;絮瓣脱落率与对照均为0。2012年3月28日，2种转基因棉的平均吐絮瓣数分别为8.0和0个，与对照相比差异也不显著;絮瓣脱落率与对照均为0(表4)。这表明转cry1Ac+cry2Ab基因棉和转cry1Ac+EPSPS基因棉吐絮瓣竞争优势均不显著，且吐絮的棉瓣不能脱落，丧失了繁殖机会，因此都不具有杂草化风险。

表4 2种播种方式下棉吐絮瓣数和絮瓣脱落率Table 4 The number of cotton boll opening valve and the floc valve dropping rate of cotton by two sowing methods

2.1.6 自生苗 2012年3月 28日，转 cry1Ac+cry2Ab基因棉、转cry1Ac+EPSPS基因棉和对照各小区均无自生苗，这是由于三者吐絮棉瓣中的棉籽(种子)均为不成熟的空壳。因此，这2种转基因棉无自生苗上的杂草化风险。

2.2 3cm深度播种竞争能力表现

2.2.1 播种前杂草情况 播种前，试验地杂草平均覆盖度98.3%，杂草平均高度20～120 cm。其中，优势杂草5种:野麦、南苜蓿、野芹菜、风花菜、猪殃殃;非优势杂草4种:野老鹳草、一年蓬、小飞蓬、羊蹄Rumex japonicus Houtt.;其他杂草数量稀少(表1)。

2.2.2 出苗竞争力 6月 5日和 7月5日:转cry1Ac+cry2Ab基因棉各小区杂草平均高度分别为52.5和46.3 cm，与对照相比差异均不显著;平均覆盖度分别为61.3%和87.5%，与对照相比差异均显著(表2);平均出苗率分别为13.8%和18.1%，与对照相比，前者差异不显著，后者差异显著(表3)。转cry1Ac+EPSPS基因棉各小区杂草平均高度分别为61.3和41.3 cm，与对照相比，前者差异显著，后者差异不显著;平均覆盖度分别为75.0%和88.8%，与对照相比差异均显著(表2);平均出苗率分别为10.6%和8.8%，与对照相比差异均不显著(表3)。这表明2种转基因棉在6～7月出苗竞争力较弱，棉苗被杂草覆盖。

8月5日和9月5日:转cry1Ac+cry2Ab基因棉各小区杂草平均高度分别为110.0和120 cm，与对照相比差异均不显著;平均覆盖度均为100%，与对照相等(表2);平均出苗率分别为20.6%和24.4%，与对照相比差异均显著(表3)。转cry1Ac+EPSPS基因棉各小区杂草平均高度分别为87.5和115.0 cm，与对照相比差异均不显著;平均覆盖度均为100%，与对照相等(表3);平均出苗率分别为14.4%(与对照差异不显著)和15.6%(与对照相等)，棉苗被杂草覆盖。

出苗竞争力方面杂草化风险评估:(1)在整个生长期中，转cry1Ac+cry2Ab基因棉出苗率竞争优势与对照相比均未达到显著水平，因此不具有显著的杂草化风险;(2)转cry1Ac+EPSPS基因棉出苗竞争力与对照相比，在7月份之前处于弱势，到9月份出苗率与对照相等，所以其在出苗竞争力方面也不具有杂草化风险。

2.2.3 株高竞争力 7月5日、8月5日、9月5日和10月5日，转cry1Ac+cry2Ab基因棉平均株高分别为 25.00、29.50、33.92 和 33.93 cm，转 cry1Ac+EPSPS 基因棉平均株高分别为 21.25、30.25、40.51和40.52 cm，与对照相比差异均不显著(表3);11月5日，各小区杂草已处于枯萎状态。由此可见，这2种转基因棉株高竞争力与对照相比均无显著优势，不具有杂草化风险。

2.2.4 生育进程竞争力 转cry1Ac+cry2Ab基因棉、转cry1Ac+EPSPS基因棉在生育进程上与对照均一致(表3)，无竞争优势，这也说明它们无杂草化风险。

2.2.5 吐絮瓣和絮瓣脱落竞争力 2011年11月5日，转cry1Ac+cry2Ab基因棉和转cry1Ac+EPSPS基因棉平均吐絮瓣数分别为6.8和11个，与对照相比差异均显著;絮瓣脱落率和对照均为0。2012年3月28日，2种转基因棉平均吐絮瓣数分别为16.0和36.0个，与对照相比差异均极显著;絮瓣脱落率分别为0和8.3%，与对照相比差异均显著(表4)。这表明转cry1Ac+cry2Ab基因棉和转cry1Ac+EPSPS基因棉与对照相比，吐絮瓣和絮瓣脱落竞争力均呈显著的负优势，不具有繁殖传代意义上的杂草化风险。

2.2.6 自生苗 2012年3月28日，转 cry1Ac+cry2Ab基因棉、转cry1Ac+EPSPS基因棉和对照各小区均无自生苗，这是由于三者吐絮棉瓣中的棉籽(种子)均为不成熟的空壳。因此，这2种转基因棉在荒地3 cm深播下无自生苗的杂草化风险。

综上所述，在地表撒播和3 cm深度播种条件下，转cry1Ac+cry2Ab基因棉和转cry1Ac+EPSPS基因棉各项指标的竞争能力均无显著优势，在推广种植上不存在杂草化风险。

3 结论与讨论

转cry1Ac+cry2Ab基因棉、转cry1Ac+EPSPS基因棉和对照非转基因棉在荒地撒播和3 cm深播2种方式的生存竞争能力检测结果表明，仅转cry1Ac+cry2Ab基因棉撒播的平均出苗竞争优势与对照相比达到显著差异，其余检测指标与对照相比均无显著的竞争优势。因此，从整体上看，可以定性地确定受检的转cry1Ac+cry2Ab基因棉和转cry1Ac+EPSPS基因棉在推广种植上不存在杂草化风险。

本研究未调查杂草数量，而是调查了杂草覆盖度。953号公告规定，在转基因抗虫棉花生存竞争能力的荒地测定中，需调查杂草数量。作者研究发现，荒地杂草种类繁多，无法调查杂草株数，如禾本科和苜蓿类杂草，不仅难以准确计算，而且极其耗时。另外，其覆盖度也比一些大型杂草小，如一年蓬、风花菜、野芹菜等。由此可见，在植物生长竞争力方面，覆盖度指标更为重要，指标越大，说明竞争能力越强，优势也越大。因此作者认为，在荒地竞争能力检测中，无需调查杂草数量，通过调查、统计各种杂草覆盖度即可说明其占据栖息地的竞争能力。

953号公告规定，在转基因抗虫棉荒地生存竞争能力测定中，需对棉花的覆盖度做调查。作者研究发现，棉花在荒地不仅出苗少，植株瘦弱矮小，而且大部分荒地被杂草覆盖。因此认为，在荒地检测时对于棉花覆盖度可以忽略不测，除非有新的转基因棉花在荒地中表现更强的生长竞争力，则可以临时用游标卡尺逐株测量后统计棉花的覆盖度(张兴华等，2010)。

此外，本研究采用百分数方法自定义差异显著性值。在检测棉花荒地的生存竞争能力中，由于某个处理中某个重复小区会产生无苗生出、无铃吐絮、无吐絮棉瓣脱落的情况而不能进行生物统计中的方差分析和显著性检验。据作者研究，在荒地条件下棉长势不良，出苗株数稀少，彼此间量值很低，差异值较小。因此，自定义定性评价标准:＜5%为差异不显著，5% ～10%为差异显著，＞10%为差异极显著。经实践检验，此标准符合实际，且实用性强，可操作性好。在2012年初召开的“转基因抗病棉花生存竞争能力检测技术操作规程和评价指标”江西省地方标准审定会上得到评审专家的认可。

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