益生菌脱基因毒性作用的研究进展

文 / 孙二娜 张 昊 郭慧媛 任发政

（中国农业大学教育部-北京市共建功能乳品重点实验室）

1 前言

基因毒性是指能直接或间接损伤DNA的性质，包括对基因组的毒性作用引起的致突变性及其他不同效应[1]。具有基因毒性的物质可以直接或间接引起遗传物质突变。人体长期暴露于基因毒性物质当中易增加患癌症的风险。自然界中存在多种基因毒性物质，如致癌芳香烃、苯并芘、致癌芳香胺、亚硝酸化合物、黄曲霉毒素等。这些物质广泛地存在于环境当中，人体无法完全避免与基因毒性物质的接触。如果能有效降低基因毒性物质的毒性，就能降低癌症发生的风险。

已有研究表明，一些益生菌在体外实验中能够降低一些基因毒性化合物的活性，例如亚硝胺、黄曲霉毒素、多环芳烃、杂环芳香胺等[2～6]，表明益生菌具有脱基因毒性的作用。但其脱毒机制尚不明确，具有脱基因毒性的菌株资源也比较匮乏。筛选具有脱基因毒性作用的益生菌并研究其脱基因毒性机制意义重大。

2 基因毒性的定义

具有基因毒性的物质可致突变，可使原癌基因发生改变。致突变作用是指化学物质引起生物的遗传物质突然的根本变化，包括染色体畸变和基因突变。如果发生在生殖细胞上则可遗传给下一代，如发生在体细胞中则不会遗传给后代，只影响本身。体细胞突变是癌肿瘤形成的基础，已知致癌物绝大部分都有致突变作用。突变和癌变可能是一个过程的两个阶段。致癌物先与DNA发生反应，造成细胞遗传信息异常（突变），然后引起细胞癌变，形成癌肿。体外致突变性和体内致癌性有高度的相关性，致突变物的存在能导致对DNA无可挽救的损伤，从而导致癌症的发生。

3 基因毒性物质

基因毒性化合物是指能直接或间接损伤细胞DNA，产生致突变或致癌作用的物质。N-亚硝基化合物、黄曲霉毒素、多环芳烃化合物、杂环胺类化合物是分布较广的致癌物质[7]。在脱基因毒性实验中常用的基因毒性物质主要有以下几种：

3.1 4-硝基喹啉-1-氧化物

4-硝基喹啉-1-氧化物（4-Nitroquinolin 1-oxide）属硝基芳烃，是一种很强的化学诱变剂和致癌物质。由于环境中多环芳烃化合物的不完全燃烧和氮的氧化，硝基芳烃在自然界中广泛存在。许多硝基芳烃化合物能够在细菌和哺乳动物细胞内诱导基因突变。

4-NQO并非直接致癌物质，它需要进一步的活化。在代谢活化过程中发生酶还原作用，4-羟基—氨基喹啉-1-氧化物（4-HAQO）经过进一步还原后，转化为4-氨基喹啉-1-氧化物（4-AQO）[8]；研究表明，4-NQO和4-HAQO涂擦局部会诱发癌肿[9]，而4-AQO无毒。4-HAQO并非最终致癌物，仍须再次活化。这一活化过程可能是经过氨基酰基-tRNA合成酶的媒介作用，使氨基酸特别是丝氨酸与4-HQO结合，形成丝氨酸酯，然后再与鸟嘌呤或腺瞟呤结合，形成加成物[10]。另有研究观察到，4-NQO还能以外附于DNA双螺旋结构的方式与大分子呈非共价键结合，影响DNA的复制与转录等过程。最近的研究表明，经过4-NQO作用后，DNA的损伤可引起复制后修复[11]，由于复制后修复易形成碱基配对错误，可导致细胞突变或癌变，研究者认为这可作为体细胞突变学说的实验根据。

3.2 甲基硝基亚硝基胍

甲基硝基亚硝基胍是强烈的直接致癌剂，其不依赖于酶的代谢作用，直接作用于胃肠道黏膜，尤其口服时对胃有较高的致癌特异性。它主要在DNA链的复制区引起GC-AT的转化，即使在致死率很低的条件下也能对微生物产生高频的突变[12]。它在pH值低于5.5的条件下会形成亚硝酸而使菌种发生诱变，在碱性条件下形成重氮甲烷，此时它的生物学效应是重氮甲烷对DNA的烷化作用而使菌种发生诱变。

3.3 黄曲霉毒素

黄曲霉毒素B1具有很强的致癌作用，它可引起染色体畸变和DNA损伤[13]。动物实验证明长期摄入低浓度的黄曲霉毒素或短期摄入高浓度的黄曲霉毒素后均可诱发肝癌，此外还可诱发胃癌、肾癌、直肠癌、乳腺癌，卵巢及小肠等部位的肿瘤。人类流行病学调查发现，黄曲霉毒素与人类肝癌发病率呈正相关，且存在着剂量-反应关系。

4 脱基因毒性的主要研究方法

4.1 Ames实验法

Ames实验法是利用组氨酸缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌突变株为测试指示菌，观察其在受试物作用下回复突变为野生型的一种测试方法[17]。组氨酸缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌在缺乏组氨酸的培养基上不能生长。但在加有致突变原的培养基上培养，则可使突变型产生回复突变成为野生型，即恢复合成组氨酸的能力，于是就能在缺乏组氨酸的培养基上生长为菌落，通过计数菌落出现的数目就可以估算受试物诱变性的强弱。

检测系统中还包括大鼠的肝微粒体酶（S9）体外代谢活化系统，使受试物在体外受到与活体内类似的氧化活化作用，故可测出间接诱变原。

4.2 SOS显色反应

SOS 反应是E.coli受到DNA 损伤时会诱导一系列功能，而这些功能总称为SOS反应[14,15]。SOS 显色反应中用的指示菌是基因工程菌E.coli PQ 37，有多个基因突变，uvrA 突变使菌体失去了剪切修复的能力，因此对DNA 损伤试剂更敏感。rfA 突变使菌体缺乏脂多糖，使受试化合物更易渗透进入细胞。E.coli PQ 37还带有一个Sfi:Lacz融合基因，删除了正常的lac基因，因此β-半乳糖苷酶的活性严格受SOS反应中与细胞分化抑制有关的sfiA基因操纵子的控制。指示菌暴露于基因毒性物质，即可产生SOS 反应，组成该反应系统的recA 蛋白即转化为recA 蛋白水解酶。此酶可分解阻遏蛋白，受阻遏的sfiA 基因去阻遏，并启动lacZ基因翻译、转录、表达，其表达产物即为半乳糖苷酶。此酶可分解邻硝基苯β-D-半乳糖苷（ONPG），产生黄色可溶性物质，根据其颜色的深浅可对被诱导酶的数量进行定量测定，从而判断DNA 是否受损伤及受损伤的程度。可通过β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的诱导和碱性磷酸酶（组成型）的表达检测指示菌的SOS应答活性，通过SOS诱导因子检测样品的基因毒性。

4.3 高效液相色谱（HPLC）检测法

高效液相色谱是分析实验室的常用分析仪器，在益生菌脱除基因毒性实验中，采用高效液相色谱分析测定基因毒性是近年来一种新的研究方法。2007年，王芳等人进行了如下研究[19]：Lact . salivarius FDB89与4-NQO共培养后，利用SOS显色反应法检测唾液乳杆菌的脱基因毒性作用，同时采用高效液相色谱分析共培养前后的4-NQO含量变化。色谱分析条件为:C18反相色谱柱，以乙腈、水为流动相进行梯度洗脱，流速为 1 mL /min；检测波长为 365 nm。结果表明 ，唾液乳杆菌转化了4-NQO，降低了4- NQO的基因毒性，并且HPLC测定的结果与 SOS显色反应测定的结果具有良好的一致性。

与HPLC的方法相比，Ames实验与SOS显色反应是利用短期细菌系统来检测DNA 损伤，在分辨基因毒性物质和非基因毒性物质上高度敏感且特异性高。但是这两种生化方法，在测定过程中会受到初始指示菌活性、浓度以及对毒性物质的最大耐受量等因素的影响，而且实验步骤多，反应耗时，操作复杂，过程不易控制，实验之间及不同实验室之间结果误差较大[16，17]。此外，SOS显色反应是通过大肠杆菌的SOS反应诱导能力来间接表征待测化合物基因毒性大小的，将其应用在筛选脱基因毒性功能的益生菌时，只能反映基因毒性的相对减少量，不能反映益生菌发挥脱基因毒性的途径，即不能区分脱基因毒性是源于菌体对毒性物质的吸附作用还是对毒性物质的转化作用。另外，SOS显色反应用到的指示菌PQ37是基因工程菌，目前只能通过赠送的方式获得，使其广泛应用受到了一定的限制。

在王芳等人的研究中，HPLC的结果表明[18]，唾液乳杆菌脱基因毒性作用伴随着4- NQO峰面积的减少而增强，同时有新的产物峰出现。从HPLC结果可以看出，唾液乳杆菌的脱基因毒性作用是通过菌体对4-NQO的转化作用实现的。HPLC法测定唾液乳杆菌的脱基因毒性精密度高，重复性好，并且可以区分脱基因毒性的作用过程。

5 益生菌脱除基因毒性的可能机理

一般认为，益生菌对致癌物的脱毒功能主要通过两种途径实现：一种是通过菌体对有毒物质的吸附来实现；另一种是通过菌体将有毒物质转化为无毒物质的代谢过程来实现[19]。不同的菌株脱基因毒性的作用机制不尽相同。Renner等人用Ames实验研究了益生菌对含硝基的牛肉抽提物的抗突变活性，结果发现所有检测的菌株都有抗突变活性，主要是通过吸附作用降低其毒性[20]。在王芳等人的研究中，HPLC的检测结果显示，唾液乳杆菌脱基因毒性作用伴随着4-NQO峰面积的减少而增强 ，同时有新的产物峰出现[18]，表明唾液乳杆菌的脱基因毒性作用是通过菌体对4-NQO的转化作用实现的。

6 小结与展望

益生菌具有脱基因毒性的作用及潜在的抗癌功能，在癌症的预防和辅助治疗方面有很大的应用前景，但其机制还不十分清楚、菌种资源也较为匮乏。今后需利用体外脱基因毒性实验筛选具有脱基因毒性功能的益生菌菌株，进一步研究其作用特征及作用机制，为脱基因毒性菌株的应用奠定良好的基础。

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