铜绿假单胞菌医院感染现状及分子流行病学研究

潘红玲，刘凤芹，冯永钦

（枝江市人民医院，湖北 枝江443200）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一类氧化酶阳性的非发酵革兰阴性杆菌，是院内感染的主要病原菌之一，容易在ICU和神经外科、烧伤科、血液科、骨髓移植中心等医院科室进行播散并引起爆发性感染的条件致病菌。近年来，随着抗生素的滥用常引起医院感染的爆发和流行，且近年来发病呈上升趋势［1－3］。因此，进行铜绿假单胞菌临床分布分型研究，对指导临床合理用药和控制此菌耐药菌株上升有着十分重要的意义。现将本地区2年来所检出的240株铜绿假单胞菌的临床分布及基因分型情况报道如下。

1 材料与方法

1．1 菌株来源

240株铜绿假单胞菌分离于本院2009年1月—2010年12月期间住院患者送检的标本。标本类型包括痰、尿液、血液、伤口分泌物、脓液、引流液、胸水和腹水等。

1．2 试剂

氨曲南，环丙沙星，头孢吡肟，亚胺培南，头孢他啶，哌拉西林，哌拉西林／他唑巴坦，庆大霉素药敏纸片均购自OXOID公司；随机引物5，－GTTGGTGGCT－3，委托上海生物工程有限公司合成；细菌基因组DNA提取试剂盒、dNTP、100bp DNA Ladder、Taq DNA Polymerase均购自上海生物工程有限公司。

1．3 细菌鉴定

所有分离菌株的培养鉴定严格按照美国国家临床实验室标准委员会（CLSI）标准，采用BD全自动微生物鉴定系统对所有收集的菌株进行菌种鉴定。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。

1．4 RAPD分型

采用随机扩增多态性DNA（RAPD）基因分型进行细菌同源性鉴定

1．4．1 细菌DNA提取 用接种环挑取纯菌落接种于3ml LB肉汤培养液，将装有LB培养液的试管置于震荡培养箱中，37℃，140rpm／min，16－24小时培养至细菌生长对数期。然后取培养液，按照上海生物工程有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明进行DNA提取，提取的DNA模板置于－20℃保存备用。

1．4．2 RAPD基因分型 PCR反应体系参照上海生物工程有限公司Taq DNA Polymerase说明。PCR反应循环：94℃5min；94℃35s，42℃30s，72℃40s（30个循环）；72℃ 5min。PCR产物电泳，用凝胶成像系统观察PCR结果。

2 结果

2．1 送检标本分布情况

2009年1月至2010年12月住院患者送检标本6400例，其中铜绿假单胞菌240例。铜绿假单胞菌的分布情况是：痰标本174株（72．5%）、伤口分泌物36株（15．0%）、尿液24株（10．0%）、其他临床标本6株占2．5%。科室分布主要为ICU 118株（49．2%），呼吸内科24株10．0%）、普外科36株（15%）、神经外科24株（10．%）、神经内科15株（12．5%），其他科室8株（3．3%）。

2．2 240例铜绿假单胞菌的药敏结果

120株铜绿假单胞菌的多重耐药情况非常严重，对亚胺培南／美罗培南耐药率分别32．0%和35．0%，对其它大多数抗菌药物的耐药率为70%以上；具体见表1。

2．3 RAPD分型

对本次分离的240株铜绿假单胞菌进行随机扩增多态性DNA（RRAPD）基因分型，共分为7种类型：A－G。其中A型72株，B型54株，C型32株，D型28株，E型22株，F型18株，G型14株。

表1 240株铜绿假单胞菌的药敏结果（%）

3 讨论

铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，主要引起机体免疫力低下患者的机会性感染，可定植人体多个部位如皮肤、呼吸道、消化道和泌尿道，该菌还可引起医院感染的暴发流行，现已成为医院感染的常见病原菌［1－3］。本研究结果显示，铜绿假单胞菌最主要来源于痰标本，其次是伤口分泌物和尿液标本标本。240株标本临床分布主要来自ICU，呼吸内科，烧伤科，其中主要发现有49．2%的铜绿假单胞菌分布于ICU，表明可能存在本院ICU小范围的交叉感染。这提醒医疗人员应该加强医院感染监测，以防在医院形成爆发流行。

240株铜绿假单胞菌对亚胺培南／美罗培南耐药率分别32．0%和35．0%，对其它大多数抗菌药物的耐药率为70%以上，说明本地区铜绿假单胞菌的多重耐药情况非常严重，应引起重视。

由于细菌的耐药性受多种遗传因子的综合影响，不稳定，耐药谱分型只能作为流行病学调查的筛选，而不宜作为可靠的调查方法，因此单用耐药谱分型是不可靠的。RAPD技术是在聚合酶链反应基础上建立的揭示基因组多态性的分型方法，该技术的最大特点是不需要预先知道基因组序列，因而具有巨大的应用前景．现已已广泛用于细菌等微生物的基因分型，且方法简单易行、可用于分子流行病学调查，追踪传染源；同时由于RAPD分型对种和株的分辨率高，可作为铜绿假单胞菌鉴定和分型的有效手段，可在分子水平上对铜绿假单胞菌感染提供病原学及流行病学的研究，在早期发现和预防其交叉感染有重要意义［4，5］。本研究结果显示，本地区2011年检出的240例铜绿假单胞菌分为中7个基因型，其中主要以A、B 2型为主，表明我院医院感染铜绿假单胞菌可能存在院内的克隆传播。

总之，细菌耐药性特别是铜绿假单胞菌耐药问题是目前临床抗感染治疗的一个难题，为了减少耐药菌的产生，我们应该要常规监测临床常见细菌的耐药性和分子流行病学现状，预测细菌耐药性变迁，以及合理使用抗生素。

［1］Cavalcanti FL，Almeida AC，Vilela MA，et al．Changing the epidemiology of carbapenem－resistant Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian teaching hospital：the replacement of S？o Paulo metallo－β－lactamase－producing isolates［J］．Mem Inst Oswaldo Cruz．2012，107（3）：420．

［2］Zhang LN，Wang XT，Ai YH，et al．Epidemiological features and risk factors of sepsis－associated encephalopathy in intensive care unit patients：2008－2011［J］．Chin Med J（Engl），2012，125（5）：828．

［3］邓清军．重症监护病房铜绿假单胞菌肺部感染49例临床分析［J］．临床肺科杂志，2008，13（4）：463．

［4］Olmos A，CamarenaJJ，NogeiraJM，et al．Applieation of an optimized and higlily discriminatory method based on a rbitrarily primed PCR for epidemiologic analysis of methieillin－resistant Sthylococcus aureus nosoeomial infeetions［J］．J ClinMierobiol，1998，36：1128．

［5］晏 群，陈丽华，刘文恩，等．分子生物学分型技术ERIC－PCR的建立［J］．实用医学杂志，2003，19（6）：688．