甲状腺乳头状癌患者p16基因表达及意义

尹凤媛

（青岛市市立医院 输血科，山东 青岛266011）

肿瘤是一类细胞周期疾病，是多基因长期共同作用的结果［1］。抑癌基因是指能够抑制细胞癌基因活性的一类基因，其功能是抑制细胞周期，阻止细胞数目增多以及促使细胞死亡。p 16基因是新近发现的抑癌基因，它以甲基化、突变或缺失等异常形式广泛存在于各种肿瘤患者中。p16基因又称为多肿瘤 抑 制 基 因 （multiple tumor suppressor 1，MTS1），定位于人类染色体9p21，全长8．5kb，由3个外显子（exon）和2个内含子（intron）组成，3个外显子分别为126、307和11bp，它们共同编码分子量为16kDa的核苷酸蛋白（CDK4的抑制蛋白），即p16蛋白。p16含有4个独特的锚蛋白重复结构，该结构与其抑制活性有关。p16既是细胞周期有效的调控因子，又是抑制肿瘤生长的关键成分。p16与cyclinD竞争性结合CDK4或CDK6，特异性地抑制CDK4或CDK6的活性，使Rb蛋白脱磷酸化，进而阻止细胞从G1期进入S期，抑制细胞无限增殖，促进细胞衰老。正常情况下p16与cyclinD处于平衡状态，当p16基因由于甲基化、基因突变或基因缺失等原因而不能正常表达时，cyclinD便与CDK4／6优势结合，使细胞生长失去控制，细胞表型产生变化，导致肿瘤的形成。甲状腺癌是一种常见的、病因未明的内分泌性恶性肿瘤，其中甲状腺乳头状癌（PTC）约占60%－80%。我们对PTC患者血液p16基因表达情况进行了检测，现报告如下。

1 资料与方法

1．1 临床资料 我院2009年3月至2010年11月收治的原发性PTC患者121例（原发组），男性31例、女性90例，年龄36．3±14．0岁；伴淋巴结转移的甲状腺乳头状癌患者41例（转移组），男性11例、女性30例，年龄40．1±13．4岁。上述两组患者均经病理组织学与免疫组化检查确诊，其中原发组临床分期I～Ⅱ 期82例、Ⅲ～Ⅳ 期39例。对照组为130例健康体检者，男性43例，女性87例；年龄33．9±20．2岁。三组一般资料具有可比性。

1．2 血液p16基因表达检测 三组均抽取空腹静脉血4ml，EDTA－K2抗凝，－20℃保存待检测。①PCR扩增：PCR反应体系为50μl，p16基因点异常（主要发生在外显子2、3中）二对引物设计参见国内外文献［2］。②单链构象多态（SSCP）分析：取10μl PCR反应产物，加入等量95%甲酰胺染料（20 mmol／L EDTA，0．1%溴酚兰），95℃保温7min后立即置于冰浴中7min；然后用8%聚丙烯酰胺凝胶4℃下电泳3h，至溴酚兰接近凝胶底部。③用硝酸银染色后判断结果：将待分析样品与对照样品的条带进行比较，判断待分析样品p16基因表达情况。当p16基因启动因子甲基化、基因突变或等位基因失活等而不能正常表达时，与对照样品条带比较出现不表达。

1．3 统计学处理 采用SPSS 10．0软件进行统计学处理，所得数据百分率比较采用χ2检验。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 根据以上方法得出，121例原发性甲状腺乳头状癌患者和41例淋巴结转移甲状腺乳头状癌患者的p16基因异常显著高于对照组，转移组的p16基因异常显著高于原发组（P＜0．05）。见表1

临床分期Ⅲ～Ⅳ 期的原发病例中p16的表达水平与临床分期I～Ⅱ 期者有明显差异（P＜0．05）。见表2

表1 原发组、转移组与对照组p16基因异常频率例数（%）

表2 原发组临床不同分期p16基因异常例数（%）

3 讨论

遗传物质突变将导致细胞增殖周期失去控制，或同时引起其他肿瘤抑制因子损失及癌基因激活，从而引发肿瘤，是导致肿瘤发生的主要原因，p16基因编码的蛋白是细胞周期监控、驱动机制中最主要的调控蛋白，直接参予细胞周期的调控、负调节细胞增殖及分裂，是细胞周期有效调控因子，亦是抑制肿瘤细胞生长的关键因素。p16蛋白抑制Cdk4活性，是作用于细胞分裂周期（Cell Division Cycle）关键酶之一的CDK4的抑制因子，一旦p16基因因甲基化、缺失、突变等异常导致表达降低、功能缺失，则不能抑制CDK4，可导致细胞无限的增殖、恶变［3］，最终使细胞进入恶性增殖，加速肿瘤发生。p16基因已经在多种肿瘤患者中发现异常表达，因此，检测p 16基因的异常表达，是判断肿瘤的性质及预后的一项重要指标。甲状腺癌患者中p16基因的失活主要表现为启动子区的高甲基化。p16基因的甲基化可能是一个独立因素，参与了PTC的浸润与转移［4］。p16基因在不同患者、肿瘤发生发展的不同时期，甲基化的位点和频率均不同，这可能与组织细胞的代谢水平、分裂水平不同相关，是导致细胞周期紊乱的重要原因之一［5］。本研究显示，PTC组和转移组血液p16基因异常率均显著高于对照组，其中转移组的p16基因异常率显著高于PTC组，同时，研究发现PTC组Ⅲ～Ⅳ期患者p16基因异常率显著高于I～Ⅱ期的患者。这表明在甲状腺乳头状癌的发病过程中存在p16蛋白的基因表达异常，同时，研究显示p16蛋白的表达与甲状腺乳头状癌的分化程度有关，且分化程度越低的甲状腺乳头状癌，p16基因表达异常的频率越高，缺失率也越高，临床分期越晚。总之，p16蛋白表达缺失可能是因为肿瘤晚期的分子生物学改变，因此可作为评估肿瘤细胞增殖活性的一种指标。甲状腺乳头状癌发病率近几年呈上升趋势，已成为临床常见肿瘤，观察甲状腺乳头状癌患者p16的表达变化对判断患者肿瘤的易感性、预测肿瘤的预后和病理鉴别诊断有一定指导意义。在临床工作中有助于甲状腺乳头状癌的诊断和预测预后，但其作用机制还有待于进一步研究。

［1］Andratschke N，Grosu AL，Molls M，et al．Perspectives in the treatment of malignant gliomas in adults［J］．AR，2001，21（5）：3541－3591．

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［3］周清华，石应康，侯 梅，等．人非小细胞肺癌p16基因突变研究［J］．中国胸心血管外科临床杂志，1977，（4）：67．

［4］彭正良，曹仁贤，文格波，等．甲状腺乳头状癌组织中p16基因甲基化的研究［J］．现代肿瘤医学，2006，14（12）：1501．

［5］宋爱林．甲状腺乳头状癌68例临床分析［J］．河北医药，2008，30（10）：1565．