基于hsp65基因的PCR技术在检测临床标本中结核杆菌的应用

谭 笑

（湖南省结核病防治所检验科，湖南 长沙 410006）

尽管在上世纪结核得到了有效控制，但WHO数据表明，结核依然是发展中国家目前面临的重要难题[1]。据估计，全球约有1/3的人口感染结核分枝杆菌，每年新发感染数可达890～990万[2,3]。建国以来，我国结核的感染数虽然明显降低，但近年来随着结核菌基因多态性和变异、耐药结核菌的产生、HIV/AID的流行、人口和人员流动快速增加、BCG效果不佳、诊断技术低劣、防治措施削弱等因素，结核病疫情出现回升或失控趋势[4,5]。1997年WHO再次提出“遏制结核病的行动刻不容缓”。因此，寻求一种简单快速的诊断方法是全世界医疗工作者的不懈追求。

结核的常规实验室诊断方法主要包括齐-尼抗酸染色和结核分枝杆菌的分离培养。抗酸染色虽然简单，但敏感性差。而分离培养不但耗时，活菌获取也是另一大难题[6]。其余分子生物学方法如DNA探针技术，但因需要特殊设备，难以在一般实验室开展[7]。本研究旨在评价基于hsp65基因的PCR技术在结核分枝杆菌中的应用。

1 实验方法

1.1 标本处理

2011年10月湖南省结核病医院总共收集临床标本80份 （68份痰液标本，10份脑脊髓液标本和2份活组织标本），所有标本经Ziehl-neelsen染色，并按Petroff氏法处理后接种于L-J斜面培基中。种属鉴定包括对LJ培养基上生长的菌落进行形态学观察，以及尼克酸实验、硝酸盐还原酶实验和触酶试验加以证实。

对于PCR标本前的处理，首先将液化后的痰液标本加入2mL 4%NaOH中和，37℃孵育20min。随后加入18mL中和缓冲液 （每1000mL溶液中含3.40g KH2PO4和 3.55g Na2HPO4/L,pH6.8），3500g离心20min，弃上清。用1mL中和缓冲液重悬浮后置于-20℃保存。

1.2 DNA提取

解冻后的标本于6000rpm离心1min，弃上清。沉淀物用 200mL TE缓冲液 （10 mM Tris-HCl[pH8.0],1mM EDTA）重悬浮,搅拌混匀。随后将混合物置于100℃水浴15min以灭活细菌并释放其DNA。16000r/m离心5min，获取上清液并分装到无菌Ep中，-20℃保存待检。

1.3 PCR扩增

根据结核分枝杆菌hsp65基因序列设计引物。其中上游引物：5'-ACCAACGATGGTGTG TCCAT-3'，下游引物：5'-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3'，最终产物长度为441bp。100mL反应体系中含有1×PCR 缓冲液、25mm MgCl2， 2.5mM dNTP、0.5mM 引物和0.5u Taq DNA聚合酶（Roche）和适量的标本DNA，最终用ddH2O使终体积为100μL。每组PCR反应设立阳性对照（H37Rv株）和阴性对照（等等体积ddH2O）。反应体系于94℃预变性4min，随后按照以下反应条件进入 35个循环：94℃，1min，64℃复性1min，72℃延伸2min。最后一循环结束后，产物于72℃孵育10min。

1.4 PCR产物观察

扩增产物于含溴乙啶的1X Tris-硼酸盐-EDTA缓冲液中 （pH8.6）中进行琼脂糖凝胶电泳（1.5%）。当凝胶在紫外条件下在441bp位置出现肉眼可见条带判断为阳性。

1.5 测序

PCR产物直接送至公司测序。测序仪为ABI ABPRISM 310基因分析仪，操作步骤按照ABI Big Dye Terminator试剂盒的步骤进行。测序结束后用序列分析软件进行数据分析。将hsp65基因序列进行BLAST。

2 结果

2.1 结核分支杆菌检出情况

本文所研究的80份临床标本经Ziehl-Neelsen染色、分离培养显示其中59份标本有MTB感染（73.75%）。而用直接PCR法，53份标本（21份痰标本和2份脑脊液标本）呈阳性（66.25%），见表1所示。

表1 不同方法对不同来源标本结核分枝杆菌的检出情况（例，n）

2.2 PCR法与培养法一致性情况

53份PCR阳性标本显示51例分离培养阳性。8份标本在培养基中显示为阳性而在PCR检测中显示为阴性。另外有2份标本在PCR检测中显示为阳性而在培养基中显示为阴性。PCR的敏感性为86.44%（51/59）和特异性为 90.48%（19/21），其阳性预测值为96.23% (51/53)，阴性预测值为70.37%(19/27)。见表2所示。

表2 PCR与分离培养一致性情况

2.2 hsp基因DNA自动测序分析

随机挑选12份PCR反应阳性株产物进行测序，并通过BLAST对其序列进行比对后发现，4株与GenBank里登录号为FJ921154的序列一致，4例与JF921160一致，其他分别与JF21153、JF921156、JF21159和JF21161一致。这12株临床株与结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的相似性达99%以上。

3 讨论

在结核病的防控当中，MTB的早期快速诊断显得非常重要。当前，Ziehl-Neelsen染色法和MTB培养是筛查MTB感染所常规采用的技术。然而Ziehl-Neelsen染色法敏感性较低，而细菌培养法又非常费时[8]。分子生物学检测方法为结核的快速诊断提供了可能，特别是对于已接受抗生素治疗的患者，PCR依然能有效检测出MTB的DNA。特别是当常规技术的局限性对病人的健康造成严重影响的时候如，当疾病复发或者治疗失败，以及对于HIV血清阳性的病人，PCR技术具有不可替代的作用[9]。

由于临床标本（如痰液）中往往含有多种干扰PCR反应的因素，这给DNA扩增带来了一定的难度[10]。在本研究检测的70份标本中，PCR对51份标本显示了很好的敏感度和特异性。其敏感度和特异性分别达86.44%和90.48%，与国外相关报道一致[11]。目前国内外采用PCR检测临床标本的灵敏度一般在55%～90%之间，其较大差异发生的原因可能是不同的研究采用了不同的商品化试剂盒，且均以培养阳性标本作为金标准所致[12,13]。此外，在本研究当中，PCR阳性的2份临床标本培养失败，这可能是在检测前患者使用过抗生素或标本DNA提取因素所致[14]。限制PCR技术广泛应用的主要因素是假阴性，本研究当中有8例培养阳性患者PCR扩增阴性，这可能与标本本身含菌量少导致DNA提取效率低下或者存在PCR抑制物有关。

所有的分枝杆菌属均有hsp65的靶基因，它比16S rRNA基因更容易得到，在分枝杆菌属高度保守[15]。序列分析显示从临床标本中提取的DNA与MTB复合群有关。此外，hsp65基因序列是鉴别分支杆菌不同种属之间的有效工具，因此，hsp65基因可以用来区别MTB复合群与其它非结核的分枝杆菌属。这次研究的结果表明所有的序列产物序列均为MTB的共有序列，并与牛分枝杆菌具有极高的相似性。这两种菌株均属于结核分枝杆菌复合群，在生物进化过程中来自于同样的祖先。

总之，本研究证明基于hsp65基因的PCR产物是实验室诊断MTB复合群的最可靠的技术。它能有效鉴别MTB与非结核分枝杆菌。但是要鉴别MTB复合群，特别是MTB与牛分枝杆菌的区别，还有待通过对hsp65和pncA基因测序加以确定。

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