水通道蛋白1对气道高反应大鼠粘液高分泌的影响

熊本强，李 翔，李喜兵，陈秋霞，张坚松

（湖南师范大学医学院应用生理研究室，湖南 长沙 410006）

气道粘液是由糖蛋白、脂、非糖蛋白类蛋白质、无机盐和水等组成，在生理条件下在气道表面分泌的数量较少，维持着正常粘液的粘弹性和粘液纤毛清除功能，是呼吸系统的重要防御机制之一。机体在不同状态下，气道粘液成分有很大差异，但高度糖基化的高分子量粘蛋白(mucin,MUC)始终是气道粘液的最主要成分，这些粘蛋白主要起细胞保护、粘性维持、细胞识别等作用[1-3]。在呼吸道表达的粘蛋白基因中，以MUC5AC的表达最为丰富。气道高反应性疾病时，粘蛋白表达的异常，可以导致粘液分泌量和质变化。水通道蛋白，又称水蛋白(aquaporin,AQP)，即存在于哺乳动物和植物细胞膜上转运水的特异孔道，该孔道是由一系列具有同源性的内在膜蛋白家族成员所形成，它们介导着不同类型细胞膜的跨膜水转运[4]。迄今，已从哺乳动物组织中鉴定出13种水蛋白，依次命名为AQP0～AQP12。研究表明，AQPs在呼吸系统不同部位有表达，AQP1就是其中之一。Saadoun S等认为AQP1为细胞迁移提供了一条水分子快速进入细胞的途径，并以此促进细胞运动[5]。目前对呼吸道粘液分泌和调节的研究主要集中在杯状细胞和粘膜下腺粘液性细胞对粘蛋白的分泌和粘蛋白基因对粘蛋白的表达调控方面，而水通道蛋白对呼吸道粘液分泌的作用和调节方面的研究鲜见报道。疾病状态时，AQPs表达的变化以及AQPs与支气管腺体分泌的关系尚不明确，AQPs对呼吸道粘液粘稠度的影响、对粘液分泌量的调节有待进一步研究。本实验通过臭氧应激建立气道高反应性动物模型，分组检测支气管分泌粘蛋白总量、肺组织粘蛋白基因MUC5AC表达改变和臭氧应激后肺组织AQP1的表达，分析它们之间的相关性，探讨AQP1对臭氧应激大鼠气道粘液高分泌的量和质影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

ECL发光试剂盒 (Pierce公司)，HRP山羊抗兔IgG(康成生物公司)，兔抗鼠AQP1多克隆抗体(AB3065，Chemicon 公司)，SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司)，RNA逆转录酶 (Promega公司)，DNase(RNase Free)(TaKaRa公司)，考马斯亮兰(Sigma 公司)，TEMED (Fluka 公司)，Trizol Reagent(Invitrogen 公 司 )，M-MLV Reverse Transcriptase(Promega 公司)，引物合成(Sangon 公司)，10 mmoL/L dNTP mix (Sangon 公司)，RNasin ribonuclease inhibitor(TaKaRa公司)，电泳级琼脂糖(Fluka公司)。

1.1.2 实验动物

健康SD雄性大鼠 30只，体重210±20g，由中南大学动物实验部提供。

1.2 方法

1.2.1 实验分组和模型制备

30只SD大鼠随机分为3组：正常对照组；臭氧应激组；臭氧应激＋地塞米松治疗组；每组10只。正常对照组：每天置于空气流通的笼中饲养；臭氧应激组：每天吸入2.0 ppm臭氧与新鲜空气混合气1 h；正常对照组和臭氧应激组共计饲养6 d，第7 d起，这两组每天给予生理盐水1.5 mg/kg腹腔注射治疗，共3 d；臭氧应激＋地塞米松治疗组：每天吸入2.0 ppm臭氧与新鲜空气混合气1 h，共计6 d，第7 d起，每天给予地塞米松1.5 mg/kg腹腔注射治疗，共3 d；第10 d，各组动物均采用股动脉放血处死，取右肺组织约10 mg，用去除RNA酶的小剪刀在Trizol中剪碎，冻存到-70℃以备检测。

1.2.2 支气管分泌粘蛋白总量测定

取各组动物肺组织石蜡切片，行过碘酸－雪呋(periodic acid schiff，PAS)染色，用病理图像分析仪选择所有标本直径在300～1000 μm之间，短径与长径之比≥0.6的完整气道，测定气道杯状细胞数、气道基底膜长度、气道上皮总面积以及PAS染色阳性面积，计算所有标本的杯状细胞化生指数(指每毫米气管上皮中杯状细胞数目)、上皮粘液储备指数(上皮PAS阳性染色面积比气管上皮总面积)，作为气道粘液的定量观察指标。

1.2.3 荧光实时定量RT-PCR检测各组肺组织AQP1和MUC5AC mRNA的表达

用Trizol(Invitrogen公司)法提取肺组织总RNA，取 2μg RNA 逆转录 cDNA，,其中 2μL cDNA为模板扩增，PCR仪为 ABI PRISM 7900，β-actin为内参照，引物设计见表1。

表1 定量RT-PCR引物

1.2.4 Western Blot检测各组大鼠肺组织AQP1和MUC5AC表达

常规提取肺组织蛋白质，BCA法定量，取50 μg样品加入等体积的2×SDS-PAGE样品缓冲液，沸水煮5 min，进行SDS-PAGE蛋白电泳。其后转移至PVDF膜，用TBST洗膜3次，每次10 min。按免疫印迹试剂盒(购于康成生物公司)说明步骤操作。暗室曝光、显影后用凝胶成像仪测灰度，取均值。

1.2.5 统计学处理

数据均以mean±SD表示，运用SPSS10.0统计软件对结果分析。两组间采用配对t检验，以P<0.05有统计学差异，P<0.01有显著统计学差异。

2 结果

2.1 大鼠支气管分泌粘蛋白总量的变化

肺组织石蜡切片PAS染色发现，正常对照组气道上皮完整，几乎无杯状细胞增生和粘液形成；臭氧应激组气道上皮杯状细胞增生肥大，有大量粘液形成，上皮脱落不完整，并有粘液栓的出现。臭氧应激＋地塞米松治疗组无粘液栓出现，粘液分泌明显减少。对粘液进行定量分析发现，臭氧应激组的上皮粘液储备指数和杯状细胞化生指数较正常对照组明显增高，有统计学意义(P<0.05)，经地塞米松治疗后，上皮粘液储备指数和杯状细胞化生指数有显著下降(P<0.05)(见表2)。

表2 各组大鼠气道粘液的储备指数和化生指数(mean±SD)n=10

2.2 大鼠肺组织AQP1和MUC5AC mRNA的变化

荧光实时定量RT-PCR结果表明：臭氧应激组AQP1 mRNA较正常组明显下降，MUC5AC mRNA则出现明显增高(P<0.05)；经地塞米松治疗后，AQP1 mRNA的表达增多，MUC5AC mRNA则出现明显下降(P<0.05)(见图1)。Western Blot检测结果与Realtime PCR 一致(见图 2)。

图1 各组大鼠肺组织AQP1和MUC5AC mRNA表达变化趋势

图2 Western Blot检测大鼠肺组织三种AQP1和MUC5AC蛋白表达

2.3 大鼠肺组织AQP1的变化和支气管分泌粘液量和质的相关性

在臭氧应激后，利用荧光实时定量RT-PCR和Western Blot的方法，对肺组织中三种AQP1和MUC5AC进行定量，同时，采用肺组织石蜡切片PAS染色，对支气管分泌粘蛋白总量进行定量，三者分析比较发现，臭氧应激后，AQP1表达明显下降，气道粘液分泌总量显著增加，且粘液中的MUC5AC表达随粘液增多而增高，经地塞米松治疗后，AQP1出现明显增多，粘液分泌量及MUC5AC表达显示增加，相关数据进行统计学分析，以相关系数r来衡量两者是否存在直线相关关系，结果显示：AQP1的表达与气道粘液分泌总量呈现负相关 (r=-0.9218,P<0.01)的趋势；AQP1的表达与粘液中的MUC5AC表达呈现负相关(r=-0.9351,P<0.01)的趋势；气道粘液分泌总量与粘液中的MUC5AC表达呈现正相关(r=0.9231,P<0.01)的趋势(见图 3)。

图3 肺组织AQP1含量与支气管分泌粘蛋白量和质的相关性

3 讨 论

气道粘液高分泌和持续气道炎症是多种气道高反应性疾病如支气管炎、支气管哮喘、COPD和肺囊性纤维化等的共同特征。MUC5AC是一种主要的粘蛋白基因，已证实在哮喘和COPD病人的气道是增加的。在支气管哮喘的患者及动物模型中，MUC5AC和MUC5B的分泌水平较正常对照组高。MUC5AC属分泌型粘蛋白，最初克隆自气管支气管，在胃和生殖道也有表达，主要表达于杯状细胞，在粘膜下腺体亦有表达[6-7]。本实验结果显示，大鼠肺组织有MUC5AC表达，臭氧应激数天后，大鼠气道粘液分泌量明显增加，且MUC5AC表达随之增多，两者呈现正相关趋势，提示臭氧应激导致的粘液高分泌状态与MUC5AC的表达水平有关。

AQPs是一族广泛存在于细胞膜上的持续开放的、不需要消耗能量、选择性高效转运水分子的有高度同源性的特异孔道。研究表明，AQPs家族在多种组织的液体转运生理和病理中发挥重要作用。深入研究水通道蛋白在机体内的生理及病理功能研究，对相关疾病的临床治疗和新型药物开发具有重要意义。AQP对呼吸道粘液的作用和调节还不十分清楚。最直接的证据是Song等的研究，该研究结果表明AQP4和AQP5定位于小鼠鼻咽部和上呼吸道粘膜下腺浆液性上皮细胞的基底侧面和内膜面，测定AQP4和AQP5基因剔除小鼠粘膜下腺的液体分泌量和成分，表明AQP5在粘膜下腺液体分泌中有重要作用，调节AQP5的活性，可改变肺部疾患腺体分泌[8]。本实验结果显示：臭氧应激的气道高反应大鼠肺组织AQP1 mRNA和蛋白水平表达均降低。与国外研究的腺病毒感染模型或博莱霉素肺损伤模型引起的水通道蛋白减低的结果类似[9-10]。分析其原因可能为气道高反应时气道分泌炎症介质、细胞因子、及过敏炎症导致气道损伤，引起上皮细胞的脱落和破坏，导致水通道蛋白的降低。值得关注的是，本实验还显示，随着AQP1的表达下降，气道高反应大鼠粘液分泌量明显增多，MUC5AC的表达也增多。提示AQP1的表达与气道粘液分泌总量呈现负相关的趋势；AQP1的表达与粘液中的MUC5AC表达呈现负相关的趋势。我们分析认为AQP1的降低可能导致了气道高反应时肺水在毛细血管与肺泡间的转运失衡，加重气道炎症、释放多种炎症介质，使纤毛上皮和杯状细胞比例失衡，最终导致水清除障碍，粘液高分泌，地塞米松极有可能通过对AQP1的调节加快肺泡内液体的清除、减轻肺组织的水肿程度发挥其减轻气道炎症的作用。

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