DFMG对LPC诱导人脐静脉内皮细胞角蛋白18磷酸化的影响

邢小伟，张勇，杨慧琼，戴哲娟，符晓华

（湖南师范大学医学院心血管病研究室，湖南 长沙 410006）

7-二氟亚甲基-5,4'-二甲氧基异黄酮(7-difluoromethyl-5,4'-dimethoxygenistein， DFMG),是本课题组以金雀异黄素(GEN)为先导化合物设计合成,并通过建立血管内皮氧化应激损伤模型筛选出的一种较GEN保护血管内皮氧化应激损伤作用更强的活性新化学实体[1](专利号：ZL200710104389.4)。

血管内皮的损害是动脉粥样硬化发生发展的始动因素[2]。将正常动物血管暴露于ox-LDL的主要活性成分溶血性磷脂酰胆碱 (lysophosphat-idy lcho line,LPC),也能产生与动脉粥样硬化时相似的血管内皮依赖性舒张功能的损害[3]。但是LPC损伤血管内皮细胞机制未尽明了。细胞角蛋白(cytokeratin，CK)是一个最大的中间丝家族。K18除发挥机械性支撑细胞的骨架作用外，还具有调节细胞周期、细胞凋亡的重要作用。K18的磷酸化主要位于33,52位丝氨酸(Ser33,Ser52)残基上[4],其中Ser33位磷酸化以点特异的方式调节K18与14-3-3蛋白的结合,进而调节细胞周期的进展以及细胞凋亡作用[5]。本课题组实验研究已经证实：DFMG及其先导化合物GEN可以拮抗LPC诱导HUVE-12细胞凋亡，抗体芯片结果显示，DFMG及其先导化合物GEN可以抑制LPC诱导HUVE-12细胞角蛋白18表达。基于上述研究背景及实验结果，我们提出以下科研假设：DFMG及其先导物GEN拮抗LPC诱导HUVE-12细胞凋亡作用与调节角蛋白18磷酸化表达密切相关。

为探究DFMG对LPC诱导HUVE-12细胞角蛋白18磷酸化的影响,本实验通过体外培养HUVE-12细胞,建立 LPC诱导 HUVE-12细胞凋亡模型,用流式细胞术、western blotting等方法,对照观察GEN和DFMG对LPC诱导的HUVE-12细胞角蛋白18磷酸化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 抗体与细胞系

CK18 一抗、CK18(ser33)一抗、β-actin 单克隆抗体均购自美国santa公司，二抗(Anti-goat)购自美国Jackson公司，人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells HUVE-12),武汉市中国典型培养物保藏中心提供。

1.1.2 药品与试剂

7-二氟甲氧基-5,4-二甲氧基异黄酮由本实验室参照文献方法[6]合成,纯度 >99%,分子式为C18H14O5F2,分子量为348,性状为淡黄色晶体粉末;金雀异黄素,美国 Sigma公司生产。二甲基亚砜,美国 Amresco公司生产;溶血性磷脂酰胆碱,美国 Sigma公司生产;胰蛋白酶,美国 Amresco公司生产;DMEM培养基、胎牛血清,均购自美国Hyclone公司，Annexin-V-FLUOS Staining Kit购自美国罗氏(Roche)公司，其余为国产分析纯试剂。

1.1.3 主要仪器

高速冷冻离心机,美国 Sigma公司产品;恒温水浴箱,杭州蓝天仪器厂产品;Eppendorf加样器,德国Eppendorf公司产品;EPICS-XL流式细胞仪,美国Beckerman Counter产品。二氧化碳细胞培养箱：美国Thermo公司生产，医用净化工作台：苏州净化设备公司生产，流式细胞仪:美国Beckerman counter EPICS-XL；垂直电泳仪及转膜系统:美国Bio-Rad公司；稳压稳流电泳仪北京市六一仪器厂生产，型号DYY-8B；凝胶电泳成像系统：Alpha Innotech公司生产，AiphaimagerTM 2200型号;图像分析系统:中国武汉华海公司生产；各种培养器皿、培养瓶、24 孔培养板：Becton Dickinson，USA.

1.2 方法

1.2.1 LPC诱导HUVE-12细胞凋亡模型的制备以每孔 1×106的细胞数,接种于 6孔培养板内,培养HUVE-12至细胞融合率达80%左右;弃原来培养基,分别加入含10μmol/L的LPC的添加1%胎牛血清的DMEM培养基，分别孵育6h、12h、24h和48h，每组设3个复孔，收集细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%的胎牛血清DMEM培养基吹打，制成单细胞悬液并调节细胞浓度为1×106/mL装入离心管中，1000r/min,4℃离心5min。弃上清液，冷PBS液1000r/min,4℃离心5min，弃上清液，加入配制好的100μL的Annexin-V-FLUOS标记溶液重悬细胞，15～25°C避光孵育10～15min，然后每管加入0.5毫升孵化缓冲液，随即上流式细胞仪检测细胞凋亡率，流式仪激发光波长用488nm，用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于600nm的滤器检测PI。

1.2.2 分组设计设空白对照组、溶媒对照组 (0.01%DMSO)、阳性药物对照组 (洛伐他汀50μmol/L)、LPC模型对照组、先导化合物不同浓度 (0.3,1.0,3.0μmol/L)对照组、DFMG不同浓度(0.3,1.0,3.0μmol/L)实验组。

1.2.3 DFMG对LPC诱导HUVE-12凋亡率的影响以每孔 1×106的细胞数,接种于 6孔培养板内,培养 HUVE-12至细胞融合率达80%左右;弃原来培养基,分别用不同浓度的 GEN、DFMG及洛伐他汀预孵育1 h后,在各组中分别加入10 μmol/L的LPC,每组设 3个复孔;继续孵育 24 h后,分别收集细胞,按上法用Annexin-V-FLUOS标记溶液重悬细胞，15～25°C 避光孵育 10～15 min，然后每管加入0.5mL孵化缓冲液，随即上流式细胞仪检测细胞凋亡率，以上实验重复3次。

1.2.4 DFMG对 LPC诱导的 HUVE-12细胞角蛋白18磷酸化的影响

按上述处理分组将细胞接种于75 cm2培养瓶，培养24 h后在冰上弃除培养液，用PBS液洗涤细胞两次，加入1XSDS加样缓冲液到培养瓶中，向细胞中加入PMSF的细胞裂解液50 μL，在冰上裂解30～60 min，用橡胶刮子刮下细胞移入EP管中，4℃ 12000 r/min离心5 min，吸取上清液转移入EP管-70℃保存。Bradford法蛋白定量后测定蛋白质的浓度，加入缓冲液。配胶，上样，电泳，半干转膜，封闭，分别加入一抗孵育过夜，PBST洗膜，加二抗，摇床摇1 h，PBST洗膜，加发光液发光，ImageJ分析软件采集图像并分析。

1.2.5 统计学处理

各组实验数据以均数±标准差表示,数据分析使用 SPSS17.0统计软件。 多个样本均数采用单因素方差分析 (ANOVA),两两比较采用 LSD-t检验，P<0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 LPC诱导HUVE-12细胞凋亡模型的制备

AnnexinⅤ-FITC/PI双染色流式细胞术分析结果显示，HUVE-12细胞凋亡率随着 LPC处理时间的延长而增加。10 μmol/LLPC处理 6 h后HUVE-12细胞凋亡率稍有增高，由空白对照组的1.61±0.67%上升到3.67±0.49%，但无统计学意义。10 μmol/LLPC孵育HUVE-12细胞12 h凋亡率开始增高，达到11.35±1.59%，与空白对照组比较有统计学意义 (P<0.05)。10 μmol/LLPC孵育HUVE-12细胞24 h后凋亡率显著升高到30.98±2.04%，与空白对照组相比有统计学意义(P<0.001)，而10 μmol/LLPC孵育HUVE-12细胞48 h后凋亡率急剧上升，大部分细胞出现凋亡，凋亡率达到78.31±0.79%,与 LPC24h组比有统计学意义(P<0.001)。(见表1)。

表1 LPC(10umol/L)作用不同时间HUVEC-12细胞凋亡率的比较(mean±SD)

2.2 DFMG对LPC诱导HUVE-12凋亡率的影响

AnnexinⅤ-FITC/PI双染色流式细胞术分析结果显示，LPC10 μmol/L与细胞孵育24 h后，明显诱导细胞凋亡(30.98±2.04)与空白对照组相比有统计学差异(P<0.001)。DFMG和GEN不同浓度组(0.3，1.0，3.0μmol/L) 依次降低 LPC 诱导的细胞凋亡，其中DFMG组的细胞凋亡率分别为28.50±2.06%,25.52±2.59%,13.70±2.00%; 且凋亡率均低于相应浓度GEN作用后的细胞凋亡率(33.42±2.09%,30.57±0.76%,27.29±2.49% (P<0.05)(见图 1 和图2)。

2.3 DFMG对LPC诱导的HUVE-12细胞角蛋白18磷酸化的影响

Western印迹检测结果表明：LPC可以上调ck18(ser33)蛋白表达，对未磷酸化ck18表达无明显作用，发现用DFMG、GEN预孵育LPC 10 μmol/L模型后，LPC上调上述蛋白表达的作用均不同程度地减弱，经图像分析系统分析表明，正常对照组的ck18(ser33)和B-actin产物条带积分光密度值之比为 0.52，DFMG和 GEN实验组的 ck18(ser33)和 B-actin产物条带积分光密度值之比分别为0.33和0.48，而 LPC 30μmol/L 模型组的 ck18(ser33)和 B-actin产物条带积分光密度值之比为0.69，分别为DFMG和GEN实验组的2.09倍和1.44倍。进一步证实DFMG及其先导物GEN拮抗LPC诱导HUVE-12细胞凋亡作用与调节角蛋白18磷酸化表达相关，而且相应浓度的DFMG作用强于GEN（见图 3）。

图1 DFMG对LPC诱导HUVE-12细胞凋亡率的影响

图2 DFMG对LPC诱导HUVE-12细胞凋亡率的影响

图3 DFMG对LPC诱导的HUVE-12细胞角蛋白18磷酸化的影响

3 讨论

关于动脉粥样硬化发生发展机制的学说有很多，目前尚无一个机制可以完全解释AS发生的原因。除了占主导地位的"损伤-反应假说"之外，随着近年来对细胞凋亡的关注，已有许多研究证实内皮细胞凋亡在动脉粥样硬化中起着非常重要的作用[7]。

氧化型低密度脂蛋白 (ox-LDL)是目前研究最多的致动脉粥样硬化因素。有研究表明,ox-LDL能诱导体外培养的内皮细胞发生凋亡,其作用具有剂量依赖性和时间依赖性[8],说明ox-LDL诱导内皮细胞损伤可能是其致AS机制之一。进一步研究发现,ox-LDL的主要成分是LPC，它是在低密度脂蛋白 (LDL)的氧化过程中,经磷脂酶 A2水解LDL中的磷脂酰胆碱 (PC)转化而成，LPC能完全模拟ox-LDL致动脉粥样硬化作用[9],但目前关于LPC在AS的发生过程中对细胞增殖和凋亡影响的作用机制报道尚少。

在本文的研究中，我们通过AnnexinⅤ-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡率。结合本课题组前期实验结果及预实验结果，发现10μmol/L LPC为适宜的造模浓度，LPC处理HUVE-12细胞6 h，细胞损伤作用尚比较小，但随着LPC作用时间的延长，LPC对细胞的损伤作用越来越大，凋亡率逐渐升高，10μmol/L LPC作用细胞 24 h后凋亡率为30.98±2.04%，当10μmol/L LPC作用细胞48h后细胞大量死亡，一方面原因可能与细胞老化有关，另一方面可能晚期凋亡率及坏死率过高对细胞已造成不可逆的损伤。因此，结合相关文献[1]我们认为LPC 10μmol/L作用24 h是适宜的造模浓度和作用时间。

长期以来人们认为角蛋白的主要作用是机械性的支撑作用。然而,仅仅从其结构上的功能根本无法解释角蛋白的组织和细胞特异性表达。磷酸化是角蛋白的主要翻译后修饰作用,与角蛋白的可溶性、纤维重组和角蛋白与其他胞浆内蛋白结合作用的调节有关[10]。本文实验结果证实,LPC能够诱导HUVE-12细胞凋亡，并且上调ck18(ser33)蛋白表达，对未磷酸化ck18蛋白表达无明显作用，提示我们CK18的磷酸化很可能作为一种信号参与着细胞的损伤调控和凋亡机制。相关文献 [5-6]表明，CK18的磷酸化可以调节细胞周期的进展以及细胞凋亡作用，进一步证实了LPC诱导HUVE-12细胞凋亡与上调ck18(ser33)蛋白表达密切相关。Masters[11]等研究证实14-3-3蛋白具有抑制 Bad和其他细胞凋亡相关蛋白的作用，因而认为14-3-3蛋白可能通过Bcl-2蛋白家族凋亡调控系统抑制细胞凋亡作用，而CK18Ser33位磷酸化可以调节CK18与14-3-3蛋白的结合,进而调节细胞周期的进展以及细胞凋亡[5-6]。本文的实验结果表明，不同浓度DFMG及其先导化合物 GEN,均可拮抗LPC的这种损伤作用，并不同程度的减弱LPC上调上述蛋白的作用,说明DFMG及其先导物GEN能通过下调角蛋白18磷酸化表达发挥保护LPC诱导HUVE-12细胞凋亡作用，而且相应浓度的DFMG作用强于其先导化合物GEN，其作用机制可能与阻断磷酸化的CK18通过Bcl-2蛋白家族调节细胞凋亡途径有关。但是CK18对于HUVE-12细胞凋亡的调节作用较复杂,仍需大量实验证实。本研究为进一步探讨DFMG拮抗LPC诱导HUVE-12细胞凋亡产生机制提供了实验和理论支持。

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