山胡椒挥发油抑菌活性的研究

游玉明

(重庆文理学院林学与生命科学学院，重庆 永川 402160)

山胡椒(Litsea cubeba)，又称山苍子、木姜子、山鸡椒，为樟科(Lauraceae)木姜子属多年生落叶小乔木，共有250余种，广泛分布于亚洲热带、亚热带及澳洲等地．我国长江以南各省是这一资源的生物圈，已发现近50种［1-2］．山胡椒鲜果中挥发油含量为4%～8%，其中柠檬醛含量占60%～80%(最高可达90%)，是合成香料及制药工业重要的中间体．除此之外，它还含有甲基庚烯酮、香茅醛、蒎烯、柠烯及松油醇等，是合成紫罗兰酮系列高级香料的主要原料，也是食品工业良好的天然增香剂［3-4］．据研究，山胡椒挥发油还具有广谱抗菌、平喘、抗过敏及松弛平滑肌等多种作用，被广泛地用于医药、化工及食品行业，具有广阔的开发前景［5-6］．

目前，关于山胡椒挥发油成分及抑菌活性的研究均为采用单一的提取方法得到山胡椒挥发油［7-9］，而对不同方法提取的山胡椒挥发油中的菌活性之间是否存在差异还未见报道．因此，本研究拟比较水蒸汽蒸馏法与同时蒸馏萃取法所得到的挥发油对部分食品污染菌的抑菌效果，并在此基础上探讨其最低抑菌浓度(MIC)及热稳定性，旨在为山胡椒资源的深度利用和开发新型食品防腐剂提供理论依据．

1 材料与设备

1．1 材料与试剂

山胡椒购自重庆市开县临江镇农贸市场;乙醚、无水亚硫酸钠(均为分析纯)产自成都市科龙化工试剂厂．供试菌种：大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、荧光假单孢菌(P．Fluorescens)、黄曲霉(Penicillium sp．)、黑曲霉(Aspergillus sp．)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，均由西南大学食品科学学院实验中心提供．营养琼脂培养基用于细菌培养;马铃薯培养基(PDA)用于真菌培养．

1．2 仪器与设备

SW-CJ-2D型超净工作台(苏州净化设备有限公司);SPX-250B-II型生化培养箱(上海跃进医疗器械厂);LDZX-40AL型高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂);RE-301型旋转蒸发仪(巩义予华仪器有限公司);蒸馏萃取装置(南京銮玉化玻仪器有限公司)．

2 方法

2．1 山胡椒挥发油的提取与制备

2．1．1 水蒸汽蒸馏法(DDE)

取充分研磨后的山胡椒果实50 g，置于1 000 mL圆底烧瓶中，加入500 mL去离子水浸泡1～2 h，按《中华人民共和国药典》(2005年版)提取挥发油，将所得挥发油加入适量无水硫酸钠脱水，得到具有浓郁香气的淡黄色透明液体，置冰箱中保存待用．

2．1．2 同时蒸馏萃取法(SDE)

取研磨后的山胡椒原料50 g，置于1 000 mL圆底烧瓶中，加入500 mL去离子水浸泡1～2 h，用同时蒸馏萃取装置提取4 h，收集得到含有山胡椒挥发油的乙醚溶液，在40℃条件下用旋转蒸发仪除去乙醚，然后用无水硫酸钠脱水，得到具有浓郁香气的淡黄色透明液体，置冰箱中保存待用．

2．2 山胡椒挥发油的抑菌效果研究

吸取100 μL(106～107个/mL)菌悬液于相应的固体培养基上涂布均匀，将经干热灭菌后的滤纸片(直径6 mm)分别放入2种山胡椒挥发油中浸泡10 min，用无菌镊子取出在山胡椒挥发油中已浸泡的滤纸片贴在固体平板上，每皿贴3片，同时作对照．细菌37℃培养24 h，酵母和霉菌26℃培养3 d后观察．测定滤纸片的抑菌圈直径，结果取3次试验的平均值［10］．

2．3 最低抑菌浓度的确定

采用2 倍稀释法［10-11］，以1%Tween-80 为溶剂，将水蒸汽蒸馏法所得山胡椒挥发油配制成1、1/2、1/4、l/8、l/16、l/32、1/64、1/128、l/256等不同稀释度的溶液，取各个浓度药液1 mL分别加入到无菌培养皿中，再加入经灭菌处理并冷却至55℃左右的9 mL营养琼脂培养基(真菌用PDA)，充分混匀后冷却制成含样液平板．按前述条件接种培养，观察结果，每一浓度梯度做3组平行实验，与对照组(菌落正常生长)比较，肉眼可见菌落生长者为无抑制作用，以完全没有菌落生长的最小质量浓度为其MIC，以1%Tween-80溶液作对照．

2．4 温度对山胡椒挥发油抑菌效果的影响

将山胡椒挥发油分别置于80、100、121℃下热处理15 min后，采用滤纸片琼脂平板扩散法测定挥发油的抑菌效果，试验重复3次．

3 结果与分析

3．1 山胡椒挥发油的抑菌效果

抑菌实验结果如表1所示，参考美国临床检验标准委员会(NCCLS)［12］推荐标准(以抑菌圈直径＞20 mm为极敏，抑菌圈直径在15～20 mm之间为高敏，抑菌圈直径在10～14 mm之间为中敏，抑菌圈直径＜10 mm为低敏，无抑菌圈为耐药)，两种提取方法所制得的挥发油均对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、荧光假单孢菌3种菌均表现为极敏，对酿酒酵母表现为中敏，对大肠杆菌表现为低敏，但对黄曲霉和黑曲霉而言，水蒸汽蒸馏法提取的挥发油的抑菌活性更强．根据余伯良等［12］的报道，山胡椒挥发油抗霉菌的有效成分其抗菌效力从强到弱依次为柠檬醛、香茅醛、山胡椒油、香叶醇、芳樟醇、甲基庚烯酮，因此水蒸汽蒸馏法提取的挥发油的抑菌活性更强．这可能是与水蒸汽蒸馏法提取的山胡椒挥发油中含有更多的柠檬醛及香茅醛等抗真菌成分有关．

表1 山胡椒挥发油抑菌效果

3．2 山胡椒挥发油对供试菌的MIC

据表1实验结果选择研究水蒸汽蒸馏法所得的山胡椒挥发油的MIC，采用2倍稀释法进行测定．由表2可知，山胡椒水蒸汽蒸馏法对不同供试菌具有不同的抑菌效果，对枯草芽孢杆菌抑菌效果最好，MIC为1/256;对金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌和黑曲霉的MIC均为1/128，而对酿酒酵母的抑菌能力最弱，其最低抑菌浓度为1/32．

表2 山胡椒水蒸汽蒸馏挥发油的MIC

3．3 温度对山胡椒挥发油抑菌效果的影响

水蒸汽蒸馏法所得山胡椒挥发油经80、100、120℃处理15 min后，对各供试菌的抑菌效果见表3．

表3 山胡椒挥发油经80、100、120℃加热处理后对各种供试菌的抑菌效果

由表3可以看出，经过不同温度加热处理，挥发油对7种供试细菌抑菌效果的影响不大，各处理温度之间抑菌圈的差异不明显．因此，可以说明水蒸汽蒸馏法所得山胡椒挥发油的抑菌活性成分具有较好的热稳定性．

4 结论

水蒸汽蒸馏法和同时蒸馏萃取法所得山胡椒挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及荧光假单胞菌的抑菌圈在20 mm以上，表现为极敏;对酿酒酵母的抑菌圈，在10～14 mm之间，表现为中敏;对大肠杆菌小于10 mm，表现为低敏;但对黄曲霉和黑曲霉而言，水蒸汽蒸馏法提取的挥发油的抑菌活性更强，水蒸汽蒸馏法所得挥发油对不同食源性微生物的MIC有差异，其中抑制枯草芽孢杆菌的MIC最小，为1/256．水蒸汽蒸馏法所得山胡椒挥发油具有良好的热稳定性，经80、100、120℃处理15 min后，其抑菌活性无明显变化．

［1］陈根洪，程超．山苍子油提取与微胶囊化研究［J］．中国粮油学报，2005，20(5)：108-110．

［2］陈学恒．我国山苍子资源利用现状和产业化前景评述［J］．林业科学，2003，39(4)：134-139．

［3］张德权，吕飞杰，台建祥．超临界CO2流体技术萃取山苍子油的研究［J］．食品与发酵工业，2000，26(2)：54-57．

［4］单秀娟，万力，董晓娜．山苍子油抗真菌的研究进展［J］．中国真菌学杂志，2007，2(4)：253-256．

［5］Kala C P．Ethnomedicinal botany of the Apatani in the Eastern Himalayan region of India［J］．J．of Ethnobio logy and Ethnomedicine，2005，1(11)：1-8．

［6］赵利琴．山胡椒属萜类及其生物活性研究进展［J］．时珍国医国药，2006，17(2)：171-174．

［7］项昭保，陈海生，夏晨燕，等．木姜子挥发油的化学成分及抑菌活性研究［J］．中成药，2008，30(10)：1514-1516．

［8］杨得坡，王发松，任三香，等．山胡椒果挥发油的化学成分与抗真菌活性［J］．中药材，1999，22(6)：295-297．

［9］王发松，杨得坡，任三香，等．山苍子叶挥发油的化学成分与抗真菌活性［J］．中药材，1999，22(8)：400-402．

［11］周峰，籍保平，李博，等．十二种中药挥发油及其滤液体外抗菌活性研究［J］．食品科学，2005，26(3)：50-53．

［12］余伯良，罗惠波，周健，等．山苍子油抗霉菌及抑制黄曲霉产毒的有效成分研究［J］．四川轻化工学院学报，2002，15(1)：32-36．