兔IL-6真核表达质粒的构建及其分子佐剂效应的初步研究

张夏兰，杨 鑫，周英顺，王红宁*

（1.四川农业大学动物科学院，四川 雅安 625014；2.四川大学生命科学学院，动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室，四川 成都 610064；3.重庆市巴南区动物疫病预防控制中心，重庆 401320）

哺乳动物白介素6是一种多功能细胞因子，又称为B细胞分化因子、干扰素J32及肝细胞刺激因子。白介素6在哺乳动物具有广泛的生物学活性，几乎能影响免疫系统的所有细胞，在调节免疫应答、影响急性期的蛋白应答和造血功能等方面发挥重要作用，并与其它细胞因子相互协调，共同构成复杂的细胞因子网络。研究表明[1－4]，哺乳动物和禽类的IL－6具有免疫佐剂效应，能增强免疫应答，同时还有资料显示[5]，细胞因子基因真核表达质粒能够增强疫苗的免疫效果。基于以上研究，本研究构建了中国白兔白介素6基因真核表达质粒pcDNA－IL－6，并与WHNRH株RHDV[6]核酸疫苗pcDNA－VP60、兔瘟组织灭活苗分别共同注射家兔后，观察其对家兔免疫应答的影响。

1 材 料

实验动物为20日龄、600～700 g的RHD非免疫中国白兔50只。质粒pMD18－T－IL－6和真核表达质粒pcDNA－VP60系本实验室构建并保存。人“O”型红细胞由成都市血站提供。溶菌酶、PEG8000，NH4Ac，异丙醇，NaOH，胰蛋白胨，酵母抽提物，小牛血清，葡萄糖，醋酸钠，冰乙酸，氯仿，苯酚，无水乙醇均为分析纯。

2 方 法

2.1 真核表达质粒pcDNA－IL－6的构建

将本实验室保存的pMD18－T－IL－6与pcDNA3.1（＋）真核表达载体质粒经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后，进行连接，并转化JM109细菌。对重组质粒进行酶切及PCR鉴定后，送大连宝生物公司测序。重组质粒命名为 pcDNA－IL－6。

2.2 质粒的大量提取及纯化

质粒DNA的大量提取，采取碱裂解法；纯化则采取PEG（聚乙二醇）沉淀法。方法均参照分子克隆第三版进行。

2.3 质粒的脂质体包被

在免疫动物前，把脂质体和质粒按1∶1的比例混合，4℃静置30 min即可使用。

2.4 动物分组及免疫

首免前实验兔耳静脉采血，分离血清，检测实验动物体内兔出血症病毒特异性抗体滴度，淘汰掉大于2 log2的兔子。将50只20日龄、600～700 g的家兔随机分为5组，免疫两次，两次免疫时间间隔20 d。实验动物免疫程序见表1。

表1 实验动物免疫程序

首免后 7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、70 d 对实验兔耳缘静脉采血，自动凝集析出并收集血清，56 ℃30 min灭活，－20℃保存待检。

2.5 特异性抗体的检测及数据分析

兔瘟特异性抗体检测采用血凝抑制（HI）试验进行，检测结果抗体效价用2n表示。应用SPSS11.0对同一时间段不同组别、同一组别不同时间段得血清特异性抗体水平进行统计和分析。

2.6 攻毒保护试验

用实验室保存地兔出血症病毒分离株WHNRH，于免疫后70 d接种试验兔，每只皮下注射0.5 ml（100LD50）进行攻毒，然后统计实验兔地发病及死亡情况，对死亡兔只做病理剖解。

3 结 果

3.1 真核表达质粒pcDNA－IL－6构建结果

通过质粒PCR、双酶切和测序鉴定（见图1），IL－6基因按照正确的阅读框架插入到pCDNA3.1（＋）质粒中，pcDNA－IL－6真核表达质粒构建成功。

图1 兔IL－6 RT－PCR及质粒p MD－IL－6鉴定结果

3.2 特异性抗体检测结果

特异性抗体检测结果，以血凝抑制抗体的最高倍比稀释倍数2的次方值表示，（若血清抗体的最高血凝抑制效价是 “5”，则血清的稀释滴度为1：25）。pcDNA－VP60真核表达质粒，与真核表达质粒pcDNAIL－6免疫兔，以及pcDNA－IL－6与不同的疫苗免疫家兔之后，均产生了不同程度的RHDV特异性抗体，各实验组与空载体对照组相比，差异均极显著（P＜0.01）。其中，核酸疫苗与pcDNAIL－6分子佐剂组合产生的抗体水平最高，单独使用核酸疫苗效果最差，各组之间抗体水平在不同的时间段的差异不一致，从从差异不显著到差异极显著。特异性抗体在首免后抗体逐步上升，二免前兔瘟组织灭活苗上升相对核酸疫苗迅速，而核酸疫苗上升缓慢。二免后RHD核酸疫苗诱导的免疫应答开始明显上升。免疫后28 d抗各种疫苗诱导体达到峰值水平，免疫后70 d有的免疫组抗体明显下降(表2)，免疫后血清抗体动态变化曲线见图2。

图2 兔免疫后血清抗体动态变化曲线

3.3 攻毒保护试验结果

攻毒后第1 d，对照组就有实验兔死亡，第2 d未注射pcDNAIL-6真核质粒组的实验兔开始死亡，第4d之后就没有实验兔死亡。攻毒后死亡情况：对照组注射质粒载体pcDNA3.1(+),实验兔全部死亡，注射核酸疫苗pcDNA-VP60组，死亡3只，其他实验组无兔只死亡。对死亡兔进行剖解，其病理变化表现为：气管和支气管黏膜充血；肝肿大，呈黄褐色，质脆；脾脏肿大，呈黑紫色；肾呈暗红色，被膜下和切面有大量出血点；肺表面有大小不等的出血斑，严重者甚至整页肺出血；膀胱内有黄褐色较浓稠的尿液；淋巴结肿大。

4 讨 论

将细胞因子重组蛋白用于佐剂存在的主要缺陷是半衰期短，其活性易受内环境如PH值、各种水解酶及血浆蛋白的影响；同时，大剂量的细胞因子还可导致发热、炎症等副作用。受DNA疫苗以质粒作为抗原载体的启发，以重组质粒表达的细胞因子，即细胞因子基因佐剂，可以克服这些缺点而得以在DNA疫苗这个领域中得到更多的重视和研究。且基因佐剂1次少量接种即可在机体内长时间低量表达，而且表达产物接近天然狗构象，是体内存在的免疫效应因子，对机体无毒副作用。

许多细胞因子，已被证实能增强DNA免疫应答的强度，发挥佐剂的作用。郭焱等[1]报道，共表达IL-6基因质粒能够促进小鼠免疫应答；龙章富等[3]报道，猪IL-6基因能够增强小鼠对猪带绦虫抗原基因的免疫应答；严琳等[4]研究报导，猪IL-6基因的原核表达产物对伪狂犬病基因缺失疫苗具有免疫佐剂效应。目前，有关中国白兔IL-6的免疫学特性研究，国内还未见报道。了解中国白兔IL-6在家兔免疫应答中的作用，具有重要意义，研究新型的分子免疫佐剂，提高疫苗免疫应答能力，有重要实用价值。

本研究首次构建了中国白兔IL-6真核表达质粒pcDNAIL-6，并将其与兔瘟组织灭活苗和pcDNA-VP60 DNA疫苗联合免疫试验兔，实验结果表明，分子佐剂pcDNAIL－6与疫苗联合免疫时可促进机体产生快速持久的免疫应答，证明了分子佐剂pcDNAIL－6对pcDNA－VP60 DNA疫苗和RHD组织灭活苗具有免疫佐剂效应，能增强机体抵抗病毒的能力，这与其他关于哺乳动物IL－6基因真核表达质粒佐剂效应研究结果基本吻合。同时，从实验结果还可以看出，从免疫后第14 d开始，共注射了pcDNAIL－6/脂质体复合物的试验组抗体水平显著高于未注射pcDNAIL－6/脂质体复合物试验组，说明真核表达质粒pcDNAIL－6在接种后14 d才表现出免疫增强作用，说明真核表达质粒进入机体后，需经10～15 d方可得到良好的表达，与DNA疫苗进入机体后诱导机体产生免疫应答的时间基本一致。

关于中国白兔IL－6分子佐剂效应研究，国内尚未见报道。本研究对中国白兔IL－6真核表达质粒分子佐剂效应的研究，为进一步研究中国白兔IL－6的免疫学特性提供了基础材料。

[1] 郭焱，金宁一，张应玖，等.共表达HIV－1与IL－6核酸疫苗质粒诱导小鼠免疫原性的研究[J].中华徽生物学和免疫学杂志,2002,22(2)：174.

[2] 郭斐，陆柔剑，孙朝晖，等.非复制重组痘苗病毒中白细胞介素6的表达及其对重组病毒免疫效果的形响[J].中华实验和临床病毒学杂志，2002,16(2)：136－141.

[3] 龙章富,高荣,孟民杰,等.脂质体包裹猪白细胞介素6基因对猪带绦虫抗原基因免疫小鼠的影响[J].高技术通讯，2003,(3)：25－29.

[4] 严琳，何启盖，陈焕春,等.猪IL－2与IL－6的原核表达及其对伪狂犬病基因缺失疫苗的佐剂效应研究[J].中国农业科学,2003,36（10)：1213－1218.

[5] 原冬伟，刘家森，郭东春，等.兔出血症病毒VP60基因真核表达质粒的构建及初步评价[J].2011,31(11)：1582－1586.

[6] 李建文，王红宁，田浪，等.兔出血症病毒（RHDV）WHNRH株的分离鉴定及基因组全序列的测定与分析[J].微生物学报，2006,46(5)：720－725.