肺炎支原体的分离鉴定与药敏性研究

2012-10-05刘展袁春丽李青凤汪水城王本旭

中国临床医学 2012年6期

刘展袁春丽李青凤汪水城王本旭

（1.北京市怀柔区妇幼保健院，北京 101400；2.北京军区疾病预防控制中心，北京 100042）

支原体肺炎是肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）引起的肺炎。支原体肺炎起病缓慢，患者有发热、阵发性刺激性咳嗽、少量黏液性或黏液脓性痰。支原体肺炎多发于青少年，患病率占肺炎的15%～30%[1]。目前临床治疗支原体肺炎的常用药物包括阿奇霉素、红霉素等[2]。本研究旨在通过探讨MP临床分离株对临床常用抗生素的敏感性，为临床治疗支原体肺炎提供用药依据。

1 资料与方法

1.1 材料乳糖酸阿奇霉素（东北制药集团沈阳第一制药有限公司，0.25 g，25万 U／瓶），头孢呋辛钠（Esseti Farmaceutici s.r.l，Italy，0.75 g／瓶），头孢曲松钠（上海罗氏制药有限公司，0.5 g／瓶），青霉素（石家庄制药集团有限公司，1 g／瓶）；美洛西林（华北制药有限公司，1 g／瓶）；乳糖酸红霉素（湖南中南科伦药业有限公司，0.25 g／瓶）；支原体培养基CM0401、CM0403、SR0059和 SR0060C（Oxoid公司，United Kingdom）；核酸分子量标准 DL2000 DNA Marker（大连宝生物工程有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 双向培养基制备 100 mL蒸馏水中加入3.55 g CM0401，121℃高压灭菌15 min，每个15 mL培养管中加入1 mL灭菌后的CM0401培养基，自然凝固。取1支SR0060C，加入20mL蒸馏水溶解。向每个培养管中加入2 mL SR0060C，4℃保存备用。

1.2.2 咽拭子标本选择性培养与鉴定将咽拭子标本浸入双向培养基中，37℃培养2周左右。当培养基颜色由红色转变为橙黄色时，将培养液于MP固体培养（CM0403＋SR0059＋琼脂粉）上划板培养，直至镜下看到“油煎蛋”样菌落长成为止。挑取菌落于双相培养基中继续培养，观察培养基颜色变化。

1.2.3 MP的PCR鉴定方法支原体核酸提取方法参照 DNeasy Blood and Tissue Kit（Qiagen，Cat No：69504）说明书进行。引物参照文献[3]设计如下：上游引物为5’—GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3’；下流引物为 5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCT-3’。反应条件为94℃，5 min；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s；28个循环；72℃处理10 min。扩增片断长度为280bp。以正常双向培养基为阴性对照。

1.2.4 MP药敏性实验将MP分别与终浓度为5 mg／mL、1 mg／mL、100μg／mL、10μg／mL、5μg／mL和1μg／mL的阿奇霉素、红霉素、头孢呋辛钠、头孢曲松钠、氨苄青霉素和美洛西林钠共同培养，观察培养基颜色的改变。待某2个浓度间培养基颜色出现变化后，进一步稀释至合适的药物浓度。阴性对照不加任何抗生素。

2 结果

经过多轮特异的选择性的双相培养基筛选，成功分离到1株MP，该支原体能够特异性地生长在双相培养基中，而且符合双相培养基颜色变化。提取MP核酸，经过PCR扩增，得到280 bp特异扩增带，与预期结果一致。见图1。

图1 MP的PCR扩增鉴定结果

当阿奇霉素、红霉素、头孢呋辛钠终浓度分别稀释至31μg／mL、125μg／mL、500μg／mL时，MP培养基颜色不变，随着抗生素浓度降低，MP培养基颜色会逐渐由红色变为橙黄色。而头孢曲松钠、美洛西林钠和氨苄青霉素在不同浓度下培养基颜色都由红色变为橙黄色。MP在不同浓度抗生素的双相培养基中颜色的相对变化指示见表1。