RNA干扰HIF-2α基因对人肺腺癌A549细胞株侵袭转移的影响

袁凯 王勇 童继春 袁卫东 陈栋

（南京医科大学附属常州第二人民医院胸心外科，江苏 常州 213003）

缺氧微环境在肺癌发生发展中起着重要作用，缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）是缺氧微环境中的关键分子[1]。研究认为，HIFs的功能主要是由α亚基决定的[2]。HIF-1α和 HIF-2α是其中两种亚型，两者虽然结构相似但功能存在差异。我们先前的研究显示，HIF-1α和 HIF-2α在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）组织中广泛表达，其中 HIF-2α表达与肿瘤大小、TNM分期以及患者预后关系密切，相反HIF-1α则无明显相关[3－4]。在另 一项研 究中，我 们对人肺 腺癌A549细胞株成功进行了缺氧培养，并在多个缺氧时点进行了 HIF－α的检测。结果显示，HIF-1α对于急性缺氧环境极为敏感，其表达在4 h即至高峰，而HIF-2α在慢性缺氧环境有持续较强表达[5]。通过该项研究我们认识到，HIF-1α和 HIF-2α在缺氧过程调节中可能各有侧重，即HIF-1α是急性缺氧期的主要反应因子，而HIF-2α则主导慢性缺氧调节。NSCLC等实体肿瘤所在的慢性缺氧环境中，HIF-2α可能发挥更大的作用。本研究利用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）技术抑制人肺腺癌细胞株A549中HIF-2α基因的表达，观察A549侵袭转移能力的变化，进一步探讨 HIF-2α在NSCLC中的生物作用机制。

1 资料与方法

1.1 材料 A549细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所，pGPU6／GFP／Neo质粒购于上海GeneP-harma制药技术有限公司，实验所需各种酶购自Takara公司，鼠抗人HIF-2α单克隆抗体购自Abcam公司，Lipofectamin 2000购自Invitrogen公司，Transwells小室购自美国Corning公司，Matrigel基质胶购自美国BD Biosciences公司。

1.2 主要仪器 CY-12C便携式氧浓度监测仪（建德市梅城电化分析仪器厂）；CO2培养箱（美国Thermo公司）；Esco垂直流／水平流超净工作台（新加坡Esco公司）；5415D小型高速离心机、5702R台式冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；Roto-Gene 3000荧光定量PCR仪（澳大利亚Corbett Research公司）；台式超声细胞破碎仪（英国SANYO公司）；酶标仪、电泳仪及电转仪（美国Bio-Rad公司）；KHY100空气恒温摇床（上海苏豪智能系统有限公司）；IX51倒置显微镜、BX51荧光显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养及分组 A549细胞在DMEM培养基中常规培养传代。实验分组：空白对照组（仅用转染试剂处理），阴性对照组（转染siRNA阴性质粒），HIF-2α-siRNA 组 （转 染 HIF-2α-siRNA 质粒）。每组设3复孔。各实验组细胞瞬时转染24 h后铺板并缺氧培养1～2 d。

1.3.2 靶向抑制HIF-2α的siRNA的设计与合成参考siRNA设计原则[6]，设计4条针对 HIF-2α的siRNA，另设计1条无关序列作为阴性对照。对于每条选定的siRNA序列，设计2条编码该序列的单链寡核苷酸（single-strand oligonucleotide，ss oligo）模板，并交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3.3 siRNA表达载体的构建 将合成的ss oligo退火，与经过Bbs I、BamH I双酶切的质粒pGPU6／GFP／Neo连接，热转化至大肠杆菌JM109中，37℃过夜培养，碱裂解法快速抽提质粒。

1.3.4 细胞转染 胰酶消化培养A549细胞并铺板。转染前将质粒DNA及10μL脂质体分别加入250μL无血清DMEM培养基中并轻轻混匀，静置混合。然后将上述混合液加入1.5 mL无血清培养基中，混匀后将其加入漂洗过的细胞中，轻柔晃动平板使之与细胞充分接触。37℃下培养6 h后将其中的培养基吸出弃去，更换新鲜培养基并置于缺氧环境下继续培养24、48 h。

1.3.5 转染效果检测 pGPU6／GFP／Neo载体可表达GFP绿色荧光蛋白，转染后24 h和48 h分别在荧光显微镜下观察5个视野，计数100个细胞，计算转染效率。

1.3.6 qRT-PCR 按常规方法提取样品总RNA，进行实时定量 PCR 检测。HIF-2α 正义链：5′-GAAAACGAGTCCGAAGCC-3′； 反 义 链：5′-CCCAAAACCAGAGCCATT-3′。β-actin 正 义 链：5′-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCTG-3′；反义链：5′-CAGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′。扩 增 反 应条件为95℃90 s；95℃5 s，58℃30 s，共40个循环，计算采用2-ΔΔCT法。实验重复3次。

1.3.7 Western-blot及酶联免疫吸附法（ELISA）检测蛋白表达 按常规方法进行。

1.3.8 Transwell检测法 取100μL Matrigel稀释后铺于Transwell小室，4℃风干。胰酶消化贴壁细胞，重悬细胞并调整至密度为1×105个／mL。取200μL细胞悬液加入Transwell小室，在下室内加入含胎牛血清的完全培养基，分别缺氧培养24 h和48 h。培养结束后，取出小室并洗膜，将滤膜用甲醛固定并染色。镜下计数上、下、左、右、中5个随机视野细胞数，取均值。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差（）表示。对于多组数据比较，采用单因素方差分析（ANOVA）检验。组间两两比较时，用Levene法进行方差齐性检验。若方差齐，采用LSD检验；若方差不齐，则用Games-Howell法进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 转染 HIF-2α-siRNA 后 HIF-2αmRNA 表达水平的变化 各组细胞HIF-2αmRNA的表达水平见表1。单因素方差分析显示，各组间HIF-2αmRNA表达水平存在显著差异（转染后24 h：F＝26.13，P＜0.01；转染后 48 h：F＝46.32，P＜0.01）。与空白对照组相比，转染后缺氧培养24 h和48 h，HIF-2α-siRNA 组 HIF-2αmRNA 表达水平均下降。在转染后24 h，4条 HIF-2α-siRNA对HIF-2αmRNA的抑制率差异有统计学意义（P＜0.01）。在 HIF-2α-siRNA 各组间两两比较显示，HIF-2α-siRNA-4组在转染后两个时点HIF-2α mRNA表达水平低于其他3组（P＜0.01）。阴性对照组HIF-2αmRNA虽略有下降，但与空白对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 A549细胞中 HIF-2α-siRNA对 HIF-2αmRNA表达的抑制作用

2.2 转染 HIF-2α-siRNA后 HIF-2α蛋白表达水平的变化 Western blot法检测HIF-2α蛋白表达，结果见表2及图1。单因素方差分析显示，各组蛋白表达差异有统计学意义（转染后24 h：F＝16.80，P＜0.01；转染后48 h：F＝223.69，P＜0.01）。组间两两比较显示，与空白对照组相比，HIF-2α-siRNA-1组在两个时点蛋白表达均无显著改变（P＞0.05）；HIF-2α-siRNA-2组在转染后48h与空白对照组相比，蛋白表达下调（P＜0.01）；HIF-2α-siRNA-3、4组细胞在转染后两个时点与空白对照组的HIF-2α蛋白表达水平相比均有显著下调（P＜0.01），而 HIF-2αsiRNA-4相较于 HIF-2α-siRNA-3组，在转染后48 h其HIF-2α蛋白水平更低（P＜0.01）。阴性对照组与空白对照组相比，在两个时点其HIF-2α蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。转染 HIF-2α-siRNA-4重组质粒的A549细胞中HIF-2α蛋白下调最为显著，且在转染后48h抑制效果最好。

表2 A549细胞中HIF-2α-siRNA对HIF-2α蛋白表达的抑制作用

图1 各组细胞中HIF-2α蛋白的Western blot分析

2.3 HIF-2α-siRNA对 A549细胞侵袭转移的影响Transwell小室法结果如表3及图2所示。方差分析显示，各组穿膜细胞数存在显著差异（24 h：F＝2471.37，P＜0.01；48 h：F＝191.24，P＜0.01）。两两比较显示，与空白对照组相比，实验组在缺氧培养两个时点其穿膜细胞数均显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。阴性对照组与空白对照组相比，穿膜细胞数差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组的穿膜细胞数

图2 Transwell法测定各组细胞的侵袭力

2.4 ELISA法检测各组细胞VEGF表达水平 本研究采用ELISA法检测各组细胞在缺氧培养24 h和48 h后血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白的表达水平，结果如表4所示。方差分析显示，各组间VEGF蛋白表达水平有显著差异（24 h：F＝26.37，P＜0.01；48 h：F＝203.30，P＜0.01）。两两比较显示，与空白对照组相比，HIF-2α-siRNA组VEGF蛋白水平在转染后两个时点均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。空白对照组与阴性对照组之间VEGF蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 各组VEGF蛋白的表达情况

3 讨 论

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种进化过程中高度保守的抵御外来基因或病毒侵犯的防御机制。siRNA是RNA干扰作用赖以发生的重要中间效应分子。siRNA是一类长21～25个核苷酸的特殊dsRNA分子，siRNA的序列与所作用的靶mRNA序列具有同源性；siRNA两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基；每条单链的3′端均有2～3个突出的非配对的碱基。研究表明，RNAi的作用机制包括起始阶段、效应阶段及反应扩大阶段。RNAi作为基因阻断技术，具有特异性强、高效性的优点。用RNAi技术来抑制目标基因的异常表达，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径。

本研究构建了4条针对HIF-2α的siRNA序列发现 HIF-2α-siRNA-4对 HIF-2α的抑制效果最为明显，在转染后24 h和48 h HIF-2αmRNA表达相较于空白组下调了（60.63±5.10）%和（80.00±3.55）%；相应在蛋白水平分别下调了（31.69±11.56）%和（82.87±4.09）%。Transwell试验结果发现，HIF-2αsiRNA组穿膜细胞数显著少于两对照组（P＜0.01），提示HIF-2α与A549细胞侵袭力有密切关系。

目前，关于HIF-1α和VEGF的关系研究较多且较深入，而对HIF-2α与VEGF的关系则研究较少。在 Wu等[3]的研究中，发现 VEGF的表达与 HIF-2α的蛋白表达密切相关。本研究采用siRNA技术抑制HIF-2α表达后，同样观察到在转染后24h和48h，VEGF表达较对照组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。综上所述，HIF-2α有望作为靶点应用于NSCLC的治疗。

[1]Bertout J A，Patel S A，Simon M C.The impact of O2 availability on human cancer[J].Nat Rev Cancer，2008，8（12）：967-975.

[2]Loboda A，Jozkowicz A，Dulak J.HIF-1 and HIF-2transcription factors-similar but not identical[J].Mol Cells，2010，29（5）：435-442.

[3]Wu X H，Qian C，Yuan K.Correlations of hypoxia-inducible factor-1alpha／hypoxia-inducible factor-2alpha expression with angiogenesis factors expression and prognosis in non-small cell lung cancer[J].Chin Med J（Engl），2011，124（1）：11-18.

[4]袁凯，郑如恒.HIF-2α与人非小细胞肺癌增殖及预后的关系[J].中国临床医学，2009，16（2）：194-197.

[5]袁凯，钱成.缺氧诱导因子-1α和缺氧诱导因子-2α在人非小细胞肺癌表达的比较[J].中华实验外科杂志，2010，27（5）：614-616.

[6]Elbashir S M，Harborth J，Weber K，et al.Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs[J].Methods，2002，26（2）：199-213.