苯甲酸雌二醇对慢性脑缺血大鼠海马胆碱乙酰转移酶变化及雌激素的影响

张燕平

河南中医学院第一附属医院神经内科 郑州 450000

慢性脑缺血或脑灌注不足伴发于脑动脉粥样硬化、血管性痴呆、Alzheimer病、Binswanger病等多种脑血管疾病的病理过程中，发病早期以认知功能损害为主要表现，最终可能导致持久或进展性认知与神经功能障碍［1］。有学者认为，脑内胆碱能系统功能障碍是慢性脑缺血患者记忆障碍和其他认知功能障碍的原因之一［2］。而胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase，CHAT）是 决 定 乙 酰 胆 碱 （acetylcholine，Ach）含量的关键因素，有关其在慢性脑缺血中的作用目前报道甚少。海马CA1区是参与学习和记忆形成的重要部位，加之此区由于对称性突触多于γ－氨基丁酸（gama aminobutyric acid，GABA）突触［3］。因此，脑组织遭受缺血后此区的神经元更易损伤。有鉴于此，本研究在建立慢性脑缺血模型并应用雌二醇进行治疗的基础上观测其行为学和海马CHAT阳性神经元的变化，进一步推测该药对慢性脑缺血大鼠可能的神经保护机制。

1 材料与方法

1.1材料健康SD大鼠，雄性，体质量300～400g，由河南省实验动物中心提供。苯甲酸雌二醇、灭菌油溶液为上海通用药业制药厂产品；CHAT试剂盒为北京中杉公司产品。

1.2方法

1.2.1 动物模型的建立：30只大鼠随机分为假手术组、缺血组和治疗组，每组各10只。制作慢性脑缺血模型：10%水合氯醛（0.3mL／100g）腹腔注射麻醉，颈部备皮并消毒后，颈正中切开皮肤，钝性分离双侧颈总动脉，结扎双侧颈总动脉的远心端与近心端后，从中间剪断；假手术组除不结扎双侧颈总动脉外，其余过程与手术组相同。

1.2.2 实验动物的处理：术后当天给药，治疗组给予苯甲酸雌二醇腹腔内注射（1mg／kg），每周2次；假手术组、缺血组给予苯甲酸雌二醇溶媒类似物——煮沸过的麻油。所有大鼠于术后饲养60d。

1.2.3 大鼠学习记忆能力测试：术后60d采用Y型电迷宫法进行主动逃避学习能力测试［9］，大鼠认知能力以达到连续10次测试中有9次（9／10）正确反应时所需的电击次数表示。术前及术后预测试1次，删除灵活性过差的大鼠。

1.2.4 免疫组化染色：学习记忆能力测试后，大鼠麻醉，打开胸腔，暴露心脏，用250mL生理盐水（37℃）经心脏灌注快速冲洗去除血细胞，再用4%多聚甲醛250mL灌注固定，快速取脑，经4%多聚甲醛固定24h，石蜡包埋后切片，片厚约4μm，免疫组化采用SP法。主要步骤为：①3%H2O2室温孵育10min；②10%正常山羊血清封闭室温孵育15min；③滴加一抗（CHAT，1：50）4℃ 过夜；④ 滴加生物素标记的二抗（1：100）37℃ 孵育30min；⑤ 滴加辣根过氧化物酶标记的卵白素（1：100）37℃ 孵育30min；⑥DAB显色；⑦PBS终止反应。脱水，透明，封片，光镜下观察。空白对照实验用PBS代替CHAT一抗。

1.2.5 CHAT的测定：于400倍光学显微镜下观察CHAT免疫组织化学阳性物质的分布，同时采用德国Leica公司图像分析系统，测定海马区阳性物质的光密度值（OD值），每张切片随机选取10个不连续视野，取其平均值，所有OD值测量均在相同的光学条件下完成。

1.2.6 统计学处理：采用SPSS 10.0统计软件处理数据，所有结果均采用均数±标准差（s）表示，用方差分析及两样本均数比较的t检验对数据进行分析，检验水准：α＝0.05。

2 结果

2.1认知能力测试结果见表1。缺血组和治疗组学会主动逃避所需的电击次数较假手术组明显增多（P＜0.01），表明认知能力下降。治疗组较缺血组认知能力改善明显（P＜0.01）。

2.2 CHAT免疫组化结果对照组海马均有大量CHAT阳性神经元和纤维分布。缺血组CHAT阳性神经元和纤维显著减少，分布稀疏，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。雌二醇治疗组CHAT阳性神经元和纤维明显增多，与缺血组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表1 术后60d3组大鼠认知能力测试结果 （s）

表1 术后60d3组大鼠认知能力测试结果 （s）

与假手术组相比，＊P＜0.01；与缺血组比较，＊＊P＜0.01

组别 n 达到学会标准所需电击次数假手术组10 34.50±7.29缺血组 10 81.67±11.02＊治疗组 10 59.33±11.33＊＊

表2 CHAT在各组鼠的表达 （s）

表2 CHAT在各组鼠的表达 （s）

与假手术组相比，＊P＜0.01；与缺血组比较，＊＊P＜0.01

组别 n 海马CA1区假手术组10 76.3710±6.5142缺血组 10 48.2500±3.3126﹡治疗组 10 75.7000±3.2111＊＊

3 讨论

基底前脑富含胆碱能神经元，该类神经元发出投射纤维至皮质、海马，并在皮质兴奋、注意力集中及学习记忆中起重要作用。胆碱能系统在学习记忆中作用逐步得到公认。已有证据表明，海马结构是参与学习和记忆功能的重要部位，且与胆碱能系统直接相关［4］。同时，海马也是大脑具有可塑性和极易受损的一个脑区，对缺血缺氧极为敏感。本实验采用持久性双侧颈总动脉结扎法造成大鼠脑组织缺血，经行为学测试存在学习记忆障碍，是较理想的慢性脑缺血模型。

CHAT是中枢神经系统合成Ach过程中重要的酶，它在胆碱能神经元胞体内合成，是胆碱能神经元的特殊标志，故常可以作为研究胆碱能神经元的标志或估计Ach含量的间接指标［5］。本实验结果发现慢性脑缺血大鼠海马CA1区CHAT的活性明显下降，同时出现行为学上的认知障碍，说明胆碱能系统在学习记忆中具有重要作用，而且说明海马CHAT的表达下降参与了慢性脑缺血的发生。

有证据表明雌激素水平低下，可直接影响神经元的活性及修复，特别是在海马、基底节、基底前脑和杏仁核，胆碱能神经元减少，突触数目降低，雌激素缺乏可加速神经元缺失，影响轴突和树突形成，同时影响多种神经递质如Ach、5－HT、NE及NGF等，干扰正常的递质代谢和信息传递，也就是说雌激素可以影响胆碱能系统和海马，影响认知功能。雌激素可能通过与NGF、BDNF及其受体的相互调节对胆碱能神经元起营养支持作用［6］。本实验发现，给予雌激素治疗后，CHAT活性明显升高，大鼠认知功能明显改善，提示雌激素可能通过增加CHAT的活性来提高Ach含量，从而对记忆功能的维持起一定作用。另有研究发现，雌激素在体给药后，脑皮层厚度和海马CA1区突触数增加，并能促进突触体谷氨酸的释放，促进培养的皮层胆碱能神经元发育，增强胆碱乙酰转移酶活性和蛋白质含量，有利于Ach合成和易化突触结构的可塑性。其中雌激素同时增强胆碱能和谷氨酸能神经元的活性可能是提高智能的关键［7］。Gibbs［8］认为雌激素可能调节神经营养因子的表达，改善胆碱能神经元CHAT活性。我们的试验结果与上述报道相符，推测雌激素有可能通过直接的或对神经营养因子调节的间接作用，改善胆碱能神经元的营养状况，增强CHAT的活性。

综上所述，雌激素通过其多靶点的药理机制，提高了海马神经元CHAT的活性，改善了慢性脑缺血大鼠海马神经细胞的胆碱能系统功能障碍，进而提高了大鼠的学习、记忆成绩。

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［9］赵崇侃，程光，陈起胜 .一种智能化的Y型迷宫［J］.中国应用生理学杂志，1997，13：363