孔雀石绿脱色菌的分离鉴定及降解特性研究

曾庆龙， 周元祥， 刘 秀， 叶红曼

（合肥工业大学 资源与环境工程学院，安徽 合肥 230009）

随着染料工业的迅速发展，染料品种和数量日益增加，它们不仅具有特定的颜色，而且结构复杂，生物可降解性较低，大多具有潜毒性特征［1］。在染料家族中，三苯甲烷染料是仅次于偶氮染料的一个大类，被广泛地应用于纺织印染、医药、造纸和制革等工业［2］。孔雀石绿是一种有毒的三苯甲烷类人工合成有机化合物，既可用作生物染色剂及丝绸、皮革和纸张等的染料，也可用来治理鱼类或鱼卵的寄生虫、真菌或细菌感染等，但是孔雀石绿具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用［3－4］，已被列为水产养殖禁用药物。因此，寻找对这类染料的特定降解菌成为人们争相关注的焦点问题［5－9］。本文研究实验室分离鉴定的3种菌株对孔雀石绿的降解特性，以进一步丰富孔雀石绿染料废水脱色处理的微生物资源，为孔雀石绿染料废水生物脱色问题提供理论资料。

1 材料与方法

1.1 菌种来源及染料

（1）菌种：从实验室ABR反应器中的活性污泥混合液中分离。

（2）染料：孔雀石绿，分析纯，λmax＝616nm。

1.2 培养基

（1）LB培养基：蛋白胨10g，NaCl 5g，酵母膏5g，蒸馏水1L，pH 7.0～7.2。

（2）选择培养基：C6H12O61.5g，（NH4）2SO40.5g，NaCl 1g，KH2PO42.65g，Na2HPO4·12H2O 4.26g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl20.02g，MnSO4·7H2O 0.002g，孔雀石绿60mg，蒸馏水1L，pH 7.0～7.2。

1.3 菌株分离与鉴定

将ABR反应器中采集的活性污泥混合液，在固体基础培养基平板上进行稀释涂布，再反复进行划线分离，获得纯菌株，将纯化后的菌株接入液体培养基中（染料质量浓度60mg／L，每支试管装10mL脱色培养基，每株菌株接3管做3次平行试验），30℃培养一定时间，筛选出能对孔雀石绿脱色的菌株。根据细菌分类鉴定标准［10］，从菌株个体形态特征、菌落特征等方面进行初步鉴定。菌株通过16SrDNA基因序列比对，对分离菌株进行系统分类鉴定。

1.4 脱色效果测定

从脱色培养液中取出5mL样液，以6000r／min的转速离心15min，缓缓倾倒出上清液，以未加染料的液体培养基为参比，测量上清液在染料最大吸收波长（λ＝616nm）处吸光度值，计算染料去除率［11］。

染料去除率＝（A0－Ae）／A0×100%，其中，A0为未接种微生物的空白对照样品的染料溶液吸光度；Ae为离心去除菌体后的上清液中残留染料的吸光度。

2 结果与分析

2.1 脱色菌的分离鉴定

用富集培养基进行5代的驯化培养，然后在固体培养基上经过多次划线分离，得到对孔雀石绿染料有脱色能力的菌株。将菌株接种于LB培养基、30℃恒温培养24h活化，活化后细菌悬液调整至吸光度A600＝0.6±0.05，取5mL菌液，将其加入50mL含60mg／L孔雀石绿染料的无机盐培养基中，30℃的恒温培养箱里静置培养，测定其脱色能力。

不同菌株对孔雀石绿染料的脱色率如图1所示，可以看出菌株 MG－2、MG－6和 MG－7对孔雀石绿脱色非常明显，脱色率均在94%以上。

3株菌对孔雀石绿染料的脱色过程如图2所示。结果表明，经过64h脱色，3株菌对孔雀石绿脱色非常明显，脱色率在94%以上，而菌株MG－2和菌株MG－7在24h内对孔雀石绿的脱色率超过82%，36h的去除率超过94%。菌株MG－6在36h内对孔雀石绿的脱色效率也能达到80%，48h的去除率达到91.71%。

图1 不同菌株对孔雀石绿的脱色率

图2 单菌株对孔雀石绿染料的脱色过程

观察菌株 MG－2、MG－6和 MG－7在营养琼脂培养基上的菌落形态特征，其结果见表1所列。将各菌株进行PCR扩增，扩增产物送交测序公司进行基因测序，获得各菌株分别从8F和1492R两端的测序结果，使用DNAStar软件包中的SeqMan软件将两侧序列进行拼接，并舍去两端可信度不高的片段，将可信度较高的片段（约1300bp）提交至NCBI网站进行序列比对，根据比对结果确定这3株菌的菌属，结果见表2所列。

表1 菌株形态观察结果

表2 16SrDNA基因测序结果（相似率均在98%以上）

2.2 菌株脱色性能研究

工业实际废水成分复杂，治理过程中存在许多限制因素，研究选用最显著的影响因子pH值、盐度、温度及氧气，观察染料孔雀石绿脱色率。

2.2.1 pH值对菌株脱色的影响

实验设计环境pH 值为5、6、7、8、9下，3株菌对60mg／L染料孔雀石绿的脱色效果。首先，配置无机盐培养基分装50mL三角瓶，灭菌后用5mol／L盐酸和2mol／L氢氧化钠溶液调节pH值分别为5、6、7、8、9。活化培养3株菌24h，以10%接种量接种于灭菌无机盐培养基中，30℃恒温培养，从12h起每6h取样测定离心后上清液在616nm处吸光度值，实验结果如图3所示。

由图3可知，3株单菌在中性条件下脱色效果最好，在偏碱性（pH＞7）条件下具有较高的脱色率，在偏酸性（pH≤6）条件下脱色率较低。菌株MG－7对pH值的适应范围较广，但其脱色过程存在较为明显的停滞现象，0～24h的脱色效果均不明显，24h后脱色效果明显上升。菌株MG－6和MG－2在处理孔雀石绿染料时停滞期相对较短，pH值在5～6时，基本无脱色效果；在pH＝7时，24h染料的脱色率达到95%；pH值在8～9时，菌株MG－2初始脱色率较高，但48h后，菌株 MG－6的脱色率高于菌株 MG－2，pH＝8时菌株MG－6的脱色率达到89.5%。

图3 pH值对脱色率的影响

2.2.2 温度对菌株脱色的影响

不同的环境温度影响菌体酶的活性而影响菌株对染料的脱色效果。本研究考察菌株在10、20、30、37、45、55℃条件下对60mg／L染料孔雀石绿的脱色效果的影响。活化培养3株菌24h，以10%接种量接种于含60mg／L孔雀石绿的灭菌无机盐培养基中，分别置于实验所需温度的恒温培养箱静置培养，从12h起每6h取样测定离心后上清液在616nm处吸光度值，实验结果如图4所示。

从图4可以看出，温度对菌株对染料孔雀石绿的脱色有明显的影响，在低温条件下（θ≤10℃）3，株菌对孔雀石绿均无明显脱色作用，随着温度升高，3株菌对孔雀石绿的脱色率先增大后减小，3株菌的最适脱色温度均为30℃。菌株MG－2和菌株 MG－6对温度的适应能力较好，在20～37℃范围内都有较高的脱色效率，菌株MG－2的脱色要快于菌株MG－6；菌株MG－7对温度的适应能力相对较差，只在温度为30℃时具有较高的脱色效率，在温度较低或较高时脱色效率都较差，其脱色过程中存在一个明显的停滞期（0～24h），24h后细菌将染料迅速降解。

图4 温度对脱色率的影响

2.2.3 氧气条件对菌株脱色的影响

本研究考察菌株在好氧、厌氧及兼氧条件下对60mg／L染料孔雀石绿的脱色效果的影响。活化培养3株菌24h，以10%接种量接种于灭菌无机盐培养基中，提供不同氧气条件，于30℃恒温静置培养48h，从12h起每6h取样测定离心后上清液在616nm处吸光度值，结果如图5所示。

图5 氧气对脱色率的影响

从图5可见，3株菌在好氧条件下对孔雀石绿的脱色率均较低，在厌氧和兼氧条件下的脱色率明显高于好氧条件。菌株MG－6在3种氧气条件下都有较高的脱色率，在厌氧和兼氧条件下的脱色过程相似，脱色效率超过95%，在好氧条件的脱色率也超过70%；菌株MG－2在厌氧和兼氧条件的脱色过程基本相同，脱色效率都超过96%，而在好氧条件下脱色率只有51%；菌株MG－7最适宜在兼氧条件下对孔雀石绿进行脱色降解，在厌氧条件下的脱色效果明显下降，在好氧条件下基本无脱色。同时，还可以发现菌株对染料的脱色速率存在差异：菌株 MG－2＞菌株MG－6＞菌株 MG－7。菌株 MG－2经活化后能立即对孔雀石绿进行降解脱色，而菌株MG－7经活化后接种到染料废水中，需要24h的停滞期才开始对染料进行降解脱色，菌株MG－6的停滞期介于两者之间。

2.2.4 盐度对菌株脱色的影响

盐度对微生物的生长繁殖和污染物的降解有着重要影响，耐盐菌具有特殊结构及理化性质，在高盐污染料废水的处理方面发挥着重要作用。以NaCl作为盐度表征，考察NaCl质量浓度为5、10、20、30、40、50g／L的条件下，对60mg／L孔雀石绿染料的脱色效果。活化培养3株菌24h，以10%接种量接种于灭菌无机盐培养基中，30℃恒温静置培养48h，从12h起每6h取样测定离心后上清液在616nm处吸光度值，实验结果如图6所示。

从图6中可以看出，菌株MG－7具有较好的耐盐性，菌株 MG－2和菌株 MG－6对盐度的适应性比菌株 MG－7差，随着ρ（NaCL）的增加，菌株对染料的脱色率出现一定程度的下降。ρ（NaCL）在10g／L以下时，盐度对菌株MG－2的脱色效果基本无影响，12h的脱色率已达到53.6%，18h后基本保持在90%以上的脱色率；ρ（NaCL）在30g／L以下时，盐度对菌株 MG－2脱色有一定程度的影响，起始脱色率降低，经过48h的处理最终脱色率趋于平稳，为82.4%；ρ（NaCL）在40～50g／L时，盐度对菌株MG－2脱色有明显的抑制作用，初始基本无脱色作用，随着时间的延长，最高脱色率为56.4%。ρ（NaCL）在10g／L以下时，菌株MG－6对染料的脱色延迟于菌株MG－2，30h后对孔雀石绿的脱色率也在90%以上；ρ（NaCL）在30g／L以下时，盐度对菌株 MG－6脱色的影响基本上与菌株 MG－2类似；ρ（NaCL）为40g／L时，虽然脱色比较缓慢，但保持上升态势；ρ（NaCL）为50g／L时，菌株 MG－6对孔雀石绿的脱色有较明显的抑制作用，起始脱色速率较快，但24h后脱色率稳定在50%左右。ρ（NaCL）为5～50g／L时，盐度对菌株MG－7的脱色没有明显影响，初始脱色率有一定差异，但30h后脱色率都保持在90%以上。上述结果说明3株菌都有一定的耐盐能力，其中菌株MG－7对盐度的适应性最强。根据文献［16］对耐盐菌的划分，3株菌都属于耐盐菌类型，这对实际污染废水处理有重要意义。

图6 盐度对脱色率的影响

2.3 脱色降解酶初步分析

将3株菌接种于无机盐培养基中培养，待48h完全脱色后，进行3组实验。第1组实验为取20mL含孔雀石绿无机盐培养基直接加入此培养液20mL；第2组实验为将此培养液离心，取上清液20mL，加入等体积含孔雀石绿无机盐培养基；第3组实验为将离心后沉淀的菌体用不含孔雀石绿的pH＝7磷酸缓冲液洗3次，再加入20 mL含孔雀石绿无机盐培养基以及20mL不含孔雀石绿无机盐培养基。3组实验均在30℃条件下，重复3次，其脱色率见表3所列。

实验结果表明：在第1组和第2组实验中，菌株对于孔雀石绿染料的脱色绿均超过90%，第3组实验菌株对染料无脱色。这说明孔雀石绿降解酶主要存在于培养液中，属于胞外酶。

表3 菌体或上清液对脱色率的影响 %

3 结 论

（1）通过驯化培养和多次划线分离，得到对孔雀石绿染料有高效脱色能力的菌株，16SrDNA基因序列比对结果表明3株高效脱色菌分属En－terobacter asburiae（MG－2）、Escherichia coli（MG－6）和Enterobacter ludwigii（MG－7）。3株菌都能有效降解孔雀石绿染料，48h对60mg／L孔雀石绿的脱色率达到97%。

（2）3株菌对孔雀石绿的最适脱色条件为：pH＝7.0，温度为30℃，兼性厌氧，且对盐度都有一定的耐适性，属于耐盐菌。

（3）在脱色过程中，菌株 MG－2基本不出现停滞期，菌株 MG－7存在24h的停滞期，菌株MG－6的停滞期时间介于两者之间。

（4）通过对孔雀石绿染料降解过程的研究，发现孔雀石绿降解酶主要存在于培养液中，属于胞外酶。

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