氯嘧磺隆高效降解菌株黑曲霉（TR－H）最佳降解条件的研究

邹月利， 陶 波

（东北农业大学，哈尔滨 150030）

氯嘧磺隆（chlorimuron－ethyl）又称豆磺隆，是美国杜邦公司于20世纪80年代开发的一种磺酰脲类除草剂。它的化学名称为［2－（4－氯－6－甲氧基嘧啶－2－氨基甲酰氨基磺酰基）苯甲酸乙酯］。氯嘧磺隆为无色晶体，是一种弱酸性化合物，pKa＝4.3。该类除草剂能防治大多数阔叶杂草，对禾本科杂草也有一定的抑制效果［1－3］。此类除草剂为内吸传导型选择性除草剂，作用靶标为植物体内的乙酰乳酸合成酶（ALS），可有效抑制氨基酸的生物合成，导致底物α－丁酮的积累，阻碍细胞分裂期间DNA的合成，最终达到除草目的［4－5］。磺酰脲类除草剂在土壤中残效期长，极低的残留量就可以对后茬敏感作物产生药害，严重影响种植结构的调整。同时，因其用量低、对哺乳动物低毒以及独特的除草活性等特点而受到人们广泛应用［6］。

磺酰脲类除草剂在土壤中的降解主要包括光解、水解和微生物降解3种途径。其中光解作用较少，大多只发生在土壤表层；化学水解大多发生在酸性及中性土壤中；在碱性土壤中，微生物对降解起着非常重要的作用。其中，pH、温度、湿度和土壤类型等环境因子均能影响微生物降解除草剂的除草活性［7－9］。目前，关于微生物降解除草剂的文献很多，尤其是在水环境和土壤中降解效果显著。因此，利用微生物降解该类除草剂污染将具有较大的应用潜力［10－12］。试验利用本科研室筛选的高效降解菌黑曲霉（TR－H）对在不同培养条件下的氯嘧磺隆降解特性进行了深入研究，采用二氯甲烷提取，利用HPLC对反应液中氯嘧磺隆定量检测，从而确定其最佳的降解条件。

1 材料及方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪，配有自动进样器和紫外检测器，美国Agilent公司；KL512氮吹浓缩仪，东联仪器设备有限公司；R－205旋转蒸发仪，上海中胜有限公司；AL－104电子天平，瑞士梅特勒－托利多仪器公司；TGL－16G超速冷冻离心机，上海安亭仪器公司。

甲醇、二氯甲烷（进口色谱纯）；娃哈哈纯净水；氯嘧磺隆标准品购自大连瑞泽农药有限公司，纯度大于97.4%；其他试剂均为分析纯。真菌黑曲霉（TR－H）为东北农业大学农药学科研室自行分离、保存的高效降解菌株。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

液相色谱采用 Agilent－ZORBAX SB－C18色谱柱（4.6mm×150mm，5.0μm），检测波长为254.0nm，柱温为28.0℃，进样体积20.0μL。流动相采用V（甲醇）∶V（水）（pH 2.5，用85.0%磷酸调节）＝75∶25，流速为0.8mL／min。

1.2.2 培养基的配制

PDA斜面培养基：取马铃薯200.0g，洗净去皮后切碎，加水煮沸30.0min，用斜面菌种的培养纱布过滤后加入20.0g葡萄糖和15.0g琼脂，蒸馏水1 000.0mL，121℃高压灭菌15min。

察式（基础）培养基：葡萄糖20.0g，蛋白胨5.0g，K2HPO41.0g，KCl 0.5g，MgSO40.5g，NaNO33.0g，FeSO40.1g，蒸馏水1 000.0mL，121 ℃高压灭菌15min［13－14］。

1.2.3 标准曲线的绘制

准确称取纯度为97.4%的氯嘧磺隆原药0.102 6g于100mL烧杯中，加30mL甲醇溶液使之溶解，定量转移至100.0mL容量瓶中，然后定容至刻度线，摇匀。得到氯嘧磺隆标准储备液的浓度为1 000.0mg／L，最后用甲醇稀释成浓度依次为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、40.0、80.0、120.0、160.0、200.0mg／L 氯嘧磺隆标准溶液，用液相色谱法进行检测。

1.2.4 最佳培养条件的确定

向250mL三角瓶内分别装入95.0mL不同pH的基础培养基，用封口膜封好后，在121.0℃条件下高温灭菌2.0h。灭菌完毕、待冷却后，分别向基础培养基中加入氯嘧磺隆储备液，使其成为不同浓度的反应液。然后再加入黑曲霉种子液，以不加黑曲霉降解菌作为对照，每组设置3个重复。最后将三角瓶置于恒温振荡培养箱中，在150r／min的摇床上在一定温度条件下避光振荡培养。每隔一定时间取样，采用液相色谱检测，从而考察不同条件下黑曲霉种子液对氯嘧磺隆除草剂的降解作用。

1.2.4.1 接种量对降解的影响

分别加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0mL黑曲霉种子液，进行降解试验，考察不同接种量对黑曲霉种子液降解氯嘧磺隆除草剂的影响。

满足发电运行工况通常要求改变原机组的旋转方向，高压侧的相序也随之改变；对于WKLF-102B励磁装置则必须在调节器的配置参数上作出相应调整。发电运行时有功功率方向将发生改变，由于发电工况运行时输出的有功功率通常比较低，功率因数自动调节方式的稳定性及对电网波动的适用能力都有可能变得很差，因此，在发电运行时不建议使用电动工况的恒功率因数自动调节方式。

1.2.4.2 培养时间对降解的影响

每隔0、1、3、5、7、15d取样，考察不同培养时间对黑曲霉种子液降解氯嘧磺隆除草剂的影响。

1.2.4.3 浓度对降解的影响

分别向基础培养基中加入氯嘧磺隆储备液，使其浓度分别为 1.0、10.0、50.0、100.0mg／L 和200.0mg／L的反应液，进行降解试验，考察黑曲霉种子液对不同浓度氯嘧磺隆除草剂的降解作用。

1.2.4.4 温度对降解的影响

分别在20.0、25.0、30.0、35.0℃和40.0 ℃条件下，进行降解试验，考察在不同培养温度条件下黑曲霉种子液对氯嘧磺隆除草剂的降解作用。

1.2.4.5 pH 对降解的影响

缓冲溶液pH 分别为5.0、7.0、9.0的反应液，以不调pH为对照，进行降解试验，考察在不同pH条件下黑曲霉种子液对氯嘧磺隆除草剂的降解作用。

每隔一定时间，在无菌操作台上取样5.0mL降解液于10.0mL离心管内；在15 000r／min、4℃条件下离心10.0min后取上清液3.0mL，加1.0g固体氯化钠（防止乳化），摇匀、使之完全溶解后，加5.0mL（3.0mL＋2.0mL）二氯甲烷萃取2次、合并有机层，加0.5g左右的无水硫酸钠干燥，将上清液转移到新的离心管内，然后用氮气吹干，用甲醇定容至1.5mL。最后用0.45μm的微孔滤膜过滤，用HPLC测定其降解率。

2 结果和讨论

2.1 方法的线性

根据液相色谱测定结果，以氯嘧磺隆除草剂原药的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制工作曲线（如图1）。得到回归方程y＝25.837x－2.196，相关系数为R＝0.999 9（n＝3）。结果表明，氯嘧磺隆除草剂在0.1～200.0mg／L范围内具有良好的线性关系，可以满足定量分析的要求。

图1 氯嘧磺隆的标准工作曲线

2.2 最佳培养条件的测定结果

2.2.1 接种量对降解的影响

待反应液培养7d时测定氯嘧磺隆的降解率，得到降解曲线（如图2）。结果表明，黑曲霉接种量在4.0～7.0mL时降解率变化较平缓，而在1.0～4.0mL和7.0～10.0mL时降解率的变化幅度较大。该结果表明，黑曲霉的接种量为5.0mL左右时氯嘧磺隆降解速率最大，降解率最高能达到96.49%。

2.2.2 培养时间对降解的影响

将反应液每隔0、1、3、5、7、15d测定氯嘧磺隆的降解率，得到降解曲线（如图3）。结果表明，反应液培养1d时黑曲霉菌株的降解率为22.80%，培养7d时降解率为96.25%，培养15d时降解率为98.06%。该结果表明，黑曲霉菌株在培养24h时开始降解氯嘧磺隆，培养到7d即可将氯嘧磺隆基本降解完全。

2.2.3 浓度对降解的影响

待反应液培养7d时测定氯嘧磺隆的降解率，得到降解曲线（如图4）。结果表明，黑曲霉菌株在含有浓度依次为1.0、10.0、50.0、100.0mg／L氯嘧磺隆培养基中的降解能力明显高于在含有200.0mg／L氯嘧磺隆培养基中的降解力，其中氯嘧磺隆含量为10.0mg／L培养基的降解率最高，为96.49%。随着氯嘧磺隆浓度的增加，黑曲霉降解除草剂的能力逐渐降低，当氯嘧磺隆的浓度增加到200.0mg／L时，降解率为90.79%。

2.2.4 温度对降解的影响

待反应液培养7d时测定氯嘧磺隆的降解率，得到降解曲线（如图5）。结果表明，反应液的温度为20.0℃时，氯嘧磺隆的降解率为84.74%。随着反应液温度的升高，黑曲霉菌株对氯嘧磺隆的降解速率随之增加，当温度升至30.0℃左右时降解率最高，为97.21%。

2.2.5 pH 对降解的影响

将反应液每隔0、1、3、5、7d测定氯嘧磺隆的降解率，绘成降解曲线（如图6）。结果表明，氯嘧磺隆在pH为7.0的反应液降解效率最低，在对照培养基中氯嘧磺隆的降解率最高，在pH为5.0和9.0的反应液降解速率基本相同。

图6 不同pH对黑曲霉降解氯嘧磺隆作用的影响

3 结论

试验系统地研究了在不同影响因素条件下，真菌黑曲霉对氯嘧磺隆降解作用的影响。确立了黑曲霉在基础培养基中最适宜的培养条件：氯嘧磺隆浓度 为 10.0mg／L、温 度 为 30.0 ℃、接 种 量 为5.0mL。虽然该菌株的最适培养温度为30.0℃，但在25.0℃和40.0℃时仍保持较好的降解活性。所以，该菌株在治理受氯嘧磺隆污染的土壤以及地下水和工业废水等方面将具有较大的应用潜力［15］。

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