传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析

单学强，李明义，高 轩＊

（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定071000；2.山东信得科技股份有限公司，山东青岛266061）

传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病［1］，给世界各国的养禽业带来了巨大经济损失。从IBDV发现至今，新的变异株和超强毒株不断出现，使得原有传统活疫苗和灭活疫苗无法阻止IBD的发生和流行。因此，迫切需要开发更加安全、有效的新型疫苗。VP2是IBDV主要的宿主保护性抗原［2］，可以诱导宿主机体产生病毒中和性抗体，具有型特异性，已成为近年来是众多学者研究的热点。

本研究利用分离的IBDV LN株基因组核酸为模板，构建重组表达质粒p ET28a－VP2；使用大肠埃希菌进行原核表达，制备VP2蛋白并分析VP2蛋白的生物学活性，为鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集发病鸡的法氏囊组织（病料来自辽宁省大连市发病鸡场），置－70℃冷冻保存；SPF鸡胚和SPF鸡购自济南昊泰实验动物繁育有限公司。

1.1.2 主要试剂 E.coli DH5α及E.coli BL21（DE3）为本实验室保存、p MD18－T 载体，购自Ta KaRa公司，p ET28a载体为本实验室保存；IBDV标准抗原及标准阳性血清，购自中国兽医药品监察所；Taq酶及限制性内切酶Eco RⅠ、Hin dⅢ，购自TaKaRa公司；MLV，购自Promega公司；TRIzol Reagent，购自Invitrogen公司；Gel Extraction Kit（50），购自OMEGA公司；HRP标记羊抗鸡IgG，购自索莱宝生物公司。

1.1.3 引物设计与合成 参照GenBank中登录的IBDV VP2序列（AB024076.1），利用生物学软件DNA Star对IBDV VP2基因进行同源性比较和限制性内切酶位点、开放阅读框（ORF）及模拟抗原表位分析，利用primer5，0软件设计两对引物进行套式PCR。扩增片段预计1 370 bp。

第一 套引物：上游引物 5′－GAC AAA CGA TCG CAG CG －3′，下游引物 5′－GGC AGG TGG GAA CAA TG－3；第二套引物：上游引物5′－GCG AAT TCA TGA CAA ACC TGC AAG ATC－3′（下划线处酶切位点为Eco RⅠ），下游引物5′－GGAAG CTTTCA CCT TAT GGC CCG GAT TAT G－3′（下划线处酶切位点为Hin dⅢ）。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分离 取法氏囊组织1.36 g，按1∶5的比例（质量比）加无菌PBS匀浆，反复冻融3次，6 000 r／min离心10 min，取上清液经0.22μm滤器过滤除菌后，经绒毛尿囊膜（CAM）途径接种9日龄SPF鸡胚10枚，每胚接种病毒液0.2 mL；另设5枚鸡胚接种生理盐水作为对照，每枚接种0.2 mL。接种后24 h内死亡的鸡胚弃去，每隔6 h照胚1次，收集120 h内死亡的鸡胚，观察鸡胚病变，收集病变明显的绒毛尿囊膜进行匀浆处理，反复冻融3次后，6 000 r／min离心10 min，取上清将分离到的病毒液，置－20℃保存备用。

1.2.2 动物回归试验 将15羽同一批次的4周龄SPF鸡随机分成两组，人工攻毒组10羽，每羽0.1 mL病毒液擦肛，正常对照组5羽，每羽0.1 mL生理盐水擦肛。在隔离器内相同条件下饲养，每日观察两组鸡的临床症状，96 h后处死全部鸡只，观察并比较病理变化。取病变典型鸡只的法氏囊组织按1∶3比例加入PBS匀浆后反复冻融3次，离心取上清进行琼脂免疫扩散试验，观察并记录结果。

1.2.3 IBDV VP2基因片段的扩增、克隆及原核表达质粒的构建 按照TRIzol说明书提取鸡胚尿囊膜中IBDV的总RNA，应用RT－PCR扩增IBDV VP2基因片段；PCR产物经过8 g／L琼脂糖凝胶电泳分析，将目的条带用凝胶回收试剂盒回收，连接到p MD18－T载体上，将阳性重组质粒命名为p MD－VP2，经过PCR及Eco RⅠ、Hin dⅢ双酶切鉴定后，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序正确后使用Eco RⅠ、Hin dⅢ分别双酶切p MD－VP2和pET28a，酶切产物用8 g／L的琼脂糖凝胶进行电泳，将目的条带分别用凝胶回收试剂盒回收后，在T4 DNA ligase的作用下16℃连接过夜。将构建好的重组表达质粒pET28a－VP2转化到E.coli DH5α感受态细胞中，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序正确后将阳性重组质粒转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞中，复苏后用于诱导表达。

1.2.4 诱导表达 在温度、时间、诱导物浓度3个单因素试验基础上，根据3个因素交互作用，对诱导表达的条件进行优化。表达产物应用SDS－PAGE和 Western blot进行分析［3］。

1.2.5 VP2蛋白的制备及免疫原性分析 取2 g诱导表达后的菌体加入20 mL含10 mL／L Triton X－100的p H8.0 PBS洗涤1次，在4℃以10 000 r／min离心2 min，弃上清。加入20 mL p H8.0的PBS，加 溶 菌 酶 至 100μg／mL，加 EDTA 至 2 mmol／L，37℃保温1 h。反复冻融3次，重悬置于冰上用超声波细胞破碎仪于功率200 W下破碎（工作4 s，间隔4 s，60次循环）后，在4℃以12 000 r／min离心20 min，收集上清加入2 mL／L的甲醛37℃恒温振荡24 h。将制备的含有VP2蛋白的上清液与白油佐剂按1∶2的比例乳化制成油乳剂疫苗。将3周龄15羽SPF鸡随机分成两组，第一组10羽每只鸡注射油乳剂疫苗0.3 mL，第二组5羽每只鸡注射0.2 mL白油佐剂作为对照组，免疫注射后3周翅下采血，分离血清，进行琼脂扩散试验。

2 结果

2.1 鸡胚接种试验

鸡胚在接种后72 h～120 h内全部死亡，死亡鸡胚尿囊膜增厚、水肿、出血。死亡胚体周身水肿，出血，以头和趾部出血较为严重，肝脏有斑驳状坏死，心脏灰白色呈熟肉样，对照组鸡胚健活。

2.2 动物回归试验

SPF鸡接种后36 h出现精神呆滞，食欲废绝，背部羽毛竖起整体呈球状，发病率达到100%；96 h处死后，可见胸肌、腿肌出血明显，法氏囊肿大，浆膜层呈现黄色胶冻样。琼脂免疫扩散试验结果表明，IBDV阳性血清与IBDV标准抗原和回归试验鸡的法氏囊组织匀浆之间均出现沉淀线，而与阴性对照之间无沉淀线出现（图1）。

图1 传染性法氏囊病病毒琼脂免疫扩散试验Fig.1 AGID analysis of IBDV

2.3 VP2基因的扩增与表达载体的构建

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，出现1条约1 373 bp的目的条带（图2），与预期片段大小一致；将构建好的p ET28a－VP2用Eco RⅠ、Hin dⅢ双酶切可以切出约1 373 bp的条带（图3），说明VP2基因已经克隆到p ET28a载体上，阳性重组质粒测序后正确。

2.4 VP2基因原核表达及鉴定

将含有阳性质粒的宿主菌，在LB液体培养基中培养至OD600 nm为0.8时，IPTG诱导终浓度为0.5 mmol／L，温度30℃，诱导表达时间8 h；以未诱导的宿主菌及诱导的p ET28a空载体做为对照组。将菌体处理后进行SDS－PAGE，结果在48 ku处出现目的条带（图4），而且以可溶的形式存在；West－ern blot的结果表明VP2蛋白可与抗鸡IBDV阳性血清发生特异性反应（图5）。说明VP2基因被正确表达，且具有反应原性。

2.5 VP2蛋白的免疫原性分析

3周龄SPF鸡免疫接种后2周，翅下采血分离血清按对倍比稀释后进行琼脂免疫扩散试验，疫苗免疫组的效价可以达到23，对照组无效价（图6）。说明VP2蛋白免疫接种后可以引起机体产生针对IBDV的中和性抗体。

3 讨论

VP2蛋白占病毒衣壳蛋白总量的51% ，是IBDV的主要宿主保护性抗原，与病毒中和抗体的诱导与识别、病毒毒力的变异、病毒的抗原漂变、细胞凋亡的诱导等有关［4］；因此利用VP2来开发基因工程疫苗成为近年来的研究热点。目前VP2基因在大肠埃希菌、酵母、昆虫细胞、禽痘病毒、腺病毒、火鸡疱疹病毒等表达系统中得到成功表达，利用其制备的 DNA 疫苗［5－6］、亚 单位疫 苗［7－8］、病毒活 载体疫苗免疫保护效果已经得到证实［9－10］。

本研究以大肠埃希菌表达系统表达的IBDV VP2蛋白作为抗原制备成油乳剂疫苗，免疫接种2周龄SPF鸡能诱导SPF鸡产生抗IBDV免疫力。说明通过原核表达系统表达的VP2蛋白具有生物学活性，只要以适宜水平、适当接种次数、适当途径（肌肉注射和皮下注射）刺激机体就可以产生较高的抗体水平。

［1］Berg T P，Gonze M，Meulemans G.Acute infectious bursal disease in poultry：isolation and characterization of a highly virulent strain［J］.Avian Pathol，1991，20（1）：133－143.

［2］Brandt M，Yao K，Liu M，et al.Molecular determinants of virulence，cell tropism，and pathogenic phenotype of infectious bursal disease virus［J］.J Virol，2001，75（24）：11974－11982.

［3］萨姆布鲁克，弗里奇，曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南［M］.2版，金冬雁，黎孟枫，等，译.北京：科学出版社，2003.

［4］祁小乐，高玉龙，高宏雷，等.鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白研究进展［J］.中国预防兽医学报，2008，30（8）：656－660.

［5］Sun J H，Yan Y X，Jiang J，et al.DNA immunization against very virulent infectious bursal disease virus with VP2－4－3 gene and chicken IL－6 gene［J］.J Vet Med B Infect Dis Vet Public

Health，2005，52（1）：1－7.

［6］Kim S J，Sung H W，Han J H，et al.Protection against very virulent infectious bursal disease virus in chickens immunized with DNA vaccines［J］.Vet Microbiol，2004，101（1）：39－51.

［7］Wu P C，Su H Y，Lee L H，et al.Secreted expression of the VP2 protein of very virulent infectious bursal disease virus in the methylotrophic yeast Pichia pastoris ［J］.J Viro Meth，2005.123（2）：221－225.

［8］Rong J，Cheng T P，Liu X N，et al.Development of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens［J］.Vaccine，2005，23（40）：4844－4851.

［9］Butter C，Sturman T D M，Baaten B J G，et al.Protection frominfectious bursal disease virus （IBDV）－induced immunization with a fowlpox recombinant containing IBDV－VP2［J］.Avian Pathol，2003，32（6）：597－604.

［10］Huang Z H，Yunus AS，Samal SK，et al.A Recombinant Newcastle disease virus（NDV）expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus（IBDV）protects against NDV and IBDV［J］.J Virol，2004，78（18）：10054－10063.