不同发育期大通牦牛心肌、骨骼肌线粒体ATP 酶活性的测定

张贵胜，李 莉，常建军，魏 青，张勤文

（1.青海省大通种牛场，青海大通810102；2.青海大学农牧学院，青海西宁810016）

大通牦牛是在青藏高原自然生态条件下，通过引入野牦牛血液培育的牦牛新品种，在同等饲养管理条件下，改良后代牦犊牛生长发育快，具有明显的个体优势，因其育成于青海省大通种牛场而得名。线粒体是真核生物细胞内的一种重要而独特的细胞器，是氧化磷酸化和形成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的主要场所，动物体新陈代谢所需的能量主要由细胞内的三磷酸腺苷直接提供，三磷酸腺苷水解释放的能量是生物体维持细胞分裂、肌肉收缩、腺体分泌、神经传导等生命活动所需能量的直接来源，所以ATP可以反映生物体新陈代谢的状况。有关牦牛低氧适应的相关机制已有一些报道，但牦牛肌组织线粒体生物学特性与低氧适应性的关系报道甚少。本试验以同一海拔地区四个年龄段大通牦牛作为研究对象，通过测定牦牛骨骼肌、心肌线粒体中Na＋－K＋－ATP、Ca2＋－Mg2＋－ATP、Ca2＋－ATP 和 Mg2＋－ATP 4种酶的活性，从发育学角度为研究大通牦牛高原低氧适应性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 青海省大通种牛场（海拔3 300 m左右）牦牛，按照出生年龄分为1、30、180日龄和成年组，共4组，每组各5头。

1.1.2 仪器及试剂 UV－1601紫外线分光光度计（SHIMADZU公司）；电子天平（瑞士产 AB204－E）；普通离心机（北京医用离心机厂LD4－2）；低温高速离心机（上海安亭）；超声波；恒温水浴锅（KS648）。ATP酶；考马斯亮蓝测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 样品采集与处理

1.2.1.1 组织的采集与处理 将牦牛屠宰后迅速取其心肌和骨骼肌组织，超低温保存，制备组织匀浆，提取线粒体，用于牦牛线粒体ATP酶活性的测定。

1.2.1.2 组织匀浆的制备和线粒体的提取 取出样本自然解冻后，在4℃的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称取1.0 g于研钵中，加入4℃生理盐水9 mL，用眼科小剪尽快剪碎组织，制备成100 g／L的组织匀浆，取100 g／L的组织匀浆用普通离心机以1 000 r／min～2 000 r／min，离心10 min，弃沉淀，取上清液以8 000 r／min～10 000 r／min（低温高速离心机离心）15 min，沉淀物为线粒体（线粒体的提取由南京建成生物工程研究所提供，中性红－詹纳斯绿B染色鉴定线粒体），将分离的线粒体用冰冷的匀浆介质制备成混悬液，用超声波细胞破碎仪将其破碎，供线粒体中ATP酶活性的测定。

1.2.2 测定方法

1.2.2.1 总蛋白的测定 按南京建成生物工程研究所提供的考马斯亮兰蛋白试剂盒测定心肌、骨骼肌线粒体提取液中蛋白质的含量，线粒体蛋白质的含量用于计算线粒体4种ATP酶的活性。

1.2.2.2 ATP酶的测定 按南京建成生物工程研究所提供的ATP酶试剂盒操作步骤测定心肌、骨骼肌线粒 体 提 取 液 中 Na＋－K＋－ATP、Ca2＋－Mg2＋－ATP、Ca2＋－ATP 和 Mg2＋－ATP 4种酶的活力，以每小时每毫克蛋白分解ATP产生1μmol无机磷的量为1个ATP酶活力单位来计算，即为μmolPi／mgprot／h。

三磷酸腺苷酶计算公式：

“＊”表示反应时间10 min，乘以6为1 h，“＊＊”表示蛋白单位mg／mL。

1.2.3 数据处理 所有数据采用SAS（6.12版）软件GLM过程进行方差分析及Duncan’s进行多重比较，检验误差为5%。

2 结果

不同发育期大通牦牛心肌线粒体ATP酶活性参数值见表1，心肌线粒体 Na＋－K＋－ATP、Mg2＋－ATP、Ca2＋－ATP和Ca2＋－Mg2＋－ATP 4种酶活性在年龄组间差异均不显著（P＞0.05）。

不同发育期大通牦牛骨骼肌线粒体ATP酶活性参数值见表2。骨骼肌线粒体 Na＋－K＋ATP、Mg2＋－ATP、Ca2＋－ATP和 Ca2＋－Mg2＋ATP 4种酶活性在年龄组间差异均不显著（P＞0.05）。

表1 不同发育期大通牦牛心肌线粒体ATP酶活性参数值（¯x±SD）Table1 The determination of cardiac mitochondrial atpase activity in various ages of yaks（¯x±SD） μmol／mg

表2 不同发育期大通牦牛骨骼肌线粒体ATP活性参数值（¯x±SD）Table2 The determination of skeletal muscle mitochondrial atpase activity in various ages of yaks（¯x±SD） μmol／mg

3 讨论

3.1 牦牛肌线粒体ATP酶活性与相关离子代谢平衡的关系

线粒体 ATP酶主要包括 Na＋－K＋－ATP、Ca2＋－Mg2＋－ATP、Ca2＋－ATP 和 Mg2＋－ATP 4 种 酶。Na＋－K＋－ATP酶和 Ca2＋－ATP酶对动物渗透压的调节、细胞内外离子平衡、膜兴奋传导、物质运输及能量代谢等方面起着重要作用。肌细胞膜上的Na＋－K＋－ATP酶是维持肌纤维结构和功能的重要蛋白，是细胞能量转换的重要系统，对保持细胞体积及p H、肌肉和神经细胞的细胞膜兴奋性、肾脏中Na＋和水的重吸收等生理过程具有重要作用［1］。Ca2＋－Mg2＋－ATP酶主要分布在骨骼肌和心肌的肌浆网上，激活时可将胞浆中的Ca2＋迅速集聚到肌浆网内部，使胞浆中Ca2＋浓度在短期内下降到原来的1／100，这是诱发肌肉舒张的关键因素。由于肌浆网内Ca2＋贮存量增加，还能增加肌肉收缩时肌浆网释放更多的Ca2＋，从而加强肌肉的收缩能力［2］。本试验的大通牦牛心肌和骨骼肌线粒体Na＋－K＋ATP，Mg2＋－ATP，Ca2＋－ATP，Ca2＋－Mg2＋ATP 4种酶活性在年龄组间差异均不显著（P＞0.05），表明大通牦牛在生长发育阶段能有效的保持Na＋－K＋离子和Ca2＋－Mg2＋离子的代谢平衡。

3.2 牦牛心肌、骨骼肌运动能力与ATP酶活性的关系

ATP酶存在于组织细胞膜及细胞器的膜上，在物质运送、能量转换以及信息传递方面具有重要的作用，因而，ATP酶活性是影响肌肉收缩张力和收缩速率的重要因素。机体在缺氧或病理状态下，ATP酶活力发生一系列转变，所以ATP酶活力的大小是评价各种细胞能量代谢及功能有无损伤的重要指标。有研究表明，急性缺氧使线粒体氧化磷酸化功能受损，ATP生成减少和ATP酶活性显著降低［3］。李彤等［4］通过低氧运动对大鼠心肌闰盘及其线粒体ATP的作用研究，结果显示，在急性低氧运动Na＋，Ca2＋－ATPase显著下降，经过4周低氧训练适应后，心肌线粒体ATP酶活性上升。夏前明等［5］报道对当脑缺血、缺氧时，ATP生成减少，细跑能量代谢障碍，Na＋－K＋－ATP酶活性降低，细胞内Na＋浓度升高，Na＋－Ca2＋交换增强，引起细胞内钙超载，最终导致细胞发生不可逆的损伤。运动中乳酸增加，p H下降，细胞内Ca2＋浓度增加，胞内K＋的持续丢失，胞外Na＋的内流，细胞膜上ATP酶含量的减少等因素都可能会降低Na＋－K＋－ATP酶的活性和数量表达［6］。本试验结果表明，在同一海拔地区，大通牦牛心肌、骨骼肌线粒体ATP酶在物质运输、能量转换及信息传递等方面发挥着稳定的作用。

3.3 牦牛心肌、骨骼肌线粒体ATP酶与年龄的关系

研究已证实，在骨骼肌中 Na＋－K＋－ATP酶主要分布在肌细胞膜，而且不同物种、不同年龄、不同类型肌纤维的细胞膜上Na＋－K＋－ATP酶的浓度不同［7］。有研究报道，4周龄的老鼠比目鱼肌细胞膜上 Na＋－K＋－泵的浓度约3 350 mol／μm2，同样年龄的蛙比目鱼肌细胞膜上 Na＋－K＋－泵的浓度约2 500 mol／μm2［8］。Suwannachot P 等［9］对5 岁至成年马的研究发现，随着年龄的增大，同一骨骼肌细胞膜上Na＋－K＋－泵的数量也随着增加。在猪的同一骨骼肌细胞膜上Na＋－K＋－泵数量的变化与年龄没有线性关系［10］。Kjeldsen K 等［11］对不同年龄的人体股外侧肌细胞膜上Na＋－K＋－泵的数量进行检测，发现Na＋－K＋泵数量与年龄之间也没有明显的关系。本试验选择的动物是牦牛新品种，具有稳定的遗传性、较高的产肉性能、优良的抗逆性及对高山高寒草场的利用性强等特点。从4个年龄组的测定数据显示，大通牦牛心肌、骨骼肌线粒体ATP酶的代谢水平与其年龄之间无明显的线性关系。

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