不同形式蛋氨酸对凡纳滨对虾肝胰腺蛋氨酸腺苷转移酶活性的影响

迟淑艳 谭北平 杨奇慧 董晓慧 刘泓宇

(广东海洋大学水产学院，广东湛江524088)

蛋氨酸在肝细胞内和三磷酸腺苷（ATP）通过蛋氨酸腺苷转移酶（Methionine adenosyl transferase，MAT）催化形成具有活性甲基的S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl Methionine,SAM），从而在体内参与诸多合成和分解代谢的化学反应，MAT是该反应的限速酶，属胞内酶。蛋氨酸是凡纳滨对虾的第一限制性氨基酸，但是，晶体蛋氨酸和微胶囊化的蛋氨酸哪种能更有效地被动物吸收、利用还不清楚。本试验通过在凡纳滨对虾饲料中添加晶体蛋氨酸和微胶囊蛋氨酸，通过放射性同位素检测方法，研究不同形式的蛋氨酸对凡纳滨对虾蛋氨酸腺苷转移酶活性的影响，以期为晶体氨基酸在对虾饲料中有效利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

配制5种等氮、等能的低鱼粉饲料（表1）。缺乏的蛋氨酸分别添加晶体L-蛋氨酸（MET,Adisseo，法国）、邻苯二甲酸醋酸纤维素(Fluka,美国)包被蛋氨酸(CAP)、棕榈酸甘油酯（Fluka，美国）包被蛋氨酸(TPA)、树脂（Eudragit П,元升工业，江苏连云港）包被蛋氨酸(RES)、羟基蛋氨酸（MHA,Alimet,Novus Internation⁃al,Inc.上海）5种形式，其中以MET为对照组。将所有粉碎好的饲料原料(过60目筛)按饲料配方(表1)混合均匀，经双螺杆制粒机[F-26(Ⅱ)，华南理工大学监制]挤压成直径1.5 mm的条状，在60℃恒温下烘干至水分为10%左右，破碎，封装备用。各处理组饲料氨基酸含量见表2。

表1 饲料配方和营养成分(%干物质)

表2 饲料中氨基酸含量(%)

1.2 饲养管理

养殖试验在粤海饲料东海岛试验场进行，选择健康凡纳滨对虾虾苗，投喂商业饲料暂养2周后随机选择600尾健康对虾进行分组。共5个处理组，每个处理3个重复，每个重复放养40尾虾[初始重(0.81±0.01)g]于300 L玻璃钢养殖桶中，每天投喂4次，饱食投喂，时间7：00、11：00、18：00、21：00，每天记录投饵量，根据查饵情况变动投喂量，每次投喂前虹吸除去残饵和蜕掉的壳。养殖期间24 h供氧，溶解氧10.45～10.5 mg/l，水温29～30 ℃，pH值7.8～8.0，养殖试验持续50 d。

1.3 样品收集及化学分析

饲养试验进行到28 d和50 d时，分别于7：00投料摄食后0.5、1、3、6、12 h进行肝胰腺取样，以蒸馏水为介质进行匀浆，1×104r/min离心取上清液，测定蛋氨酸腺苷转移酶活性（MAT）（检测方法由美国田纳西大学外科学院Malak Kotb老师和他的学生Ramy Attia提供），具体方法如下：取10 μl、5×缓冲液（250 mmol/l TES缓冲液，250 mmol/l KCl，75 mmol/l MgCl2，1.5 mmol/l EDTA，0.5 mg/ml BSA溶液），5 μl 50 mmol/l ATP，1 μl 1 mmol/l14C-L-蛋氨酸（经由中国同位素公司购自Amersham），0.2 μl、1 mol/l DTT，加入去离子水，将混合物在37 ℃孵育5 min，取40 μl放入10 μl样本中反应20 min，反应结束后分别取管中溶液20 μl，点样在经冰醋酸处理的2 cm2的P81离子交换纸，在大容器中（4 L）流水冲洗30 min，上液闪仪（Packard,Tri-carb 2900TR,Liquid scitillation analyzer）测定14C-L-蛋氨酸放射活性。MAT活性的测定在广州中山大学中山医学院放射核医学教研室完成。

2 结果分析

养殖第28 d、第50 d摄食不同形式氨基酸凡纳滨对虾肝胰腺MAT活性见图1及图2。

图1 养殖第28 d摄食不同形式蛋氨酸后12 h内凡纳滨对虾肝胰腺蛋氨酸腺苷转移酶活性

由图1看出，养殖试验进行到第28 d时，摄食后0.5 h时CAP处理组MAT活性最高，1 h时RES处理组MAT活性上升至最高，而0.5 h和1 h时，TPA处理组均保持最低；3 h时RES组回落而TPA组和CAP组上升，并且TPA组在6 h时升至最高后于12 h时回落。MET组在0.5、3 h和6 h时MAT活性均较低，但是在12 h时骤然升高，不仅高于其他各组，还高于该组在整个取样点时的MAT活性。MHA处理组在3 h时MAT活性最高。

图2 养殖第50 d摄食不同形式蛋氨酸后6 h内凡纳滨对虾肝胰腺蛋氨酸腺苷转移酶活性

在养殖第50 d时，凡纳滨对虾摄食不同形式蛋氨酸饲料6 h内，MAT活性发生了变化。摄食后0.5 h时，MET和MHA组的MAT活性较高，到1 h时3个微胶囊组的MAT活性开始上升而MET组下降，RES组上升较缓慢；3 h时RES组MAT活性持续上升，且达到观察期内的最高点，6 h时RES组MAT活性回落至最低，而此时MET组的MAT活性却突然上升至最高。MHA处理组在0.5、1和3 h时始终保持较高的MAT活性，在6 h时有所下降。

3 讨论

水生动物饲料中鱼粉蛋白源被部分或全部替代后，会导致氨基酸的缺乏，通过添加晶体氨基酸(CAA)可以弥补限制性氨基酸的不足，同时提高蛋白质的利用效率，改善凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)[1]、日本对虾(Penaeus japonicus)[2]、罗非鱼(Tilapia nilotica)[3-4]、虹鳟 (Salmo gairdnerii Richardson)[5]、斑 点 叉尾 鮰(Ictal⁃urus punctatus)[6-7]、鲤鱼(cyprinus carpio)[8]和尖吻鲈(Lates calcarifer Bloch)[9]等动物的生长。然而，水生动物利用晶体氨基酸的效果并非一致。有研究指出，动物肠道吸收CAA的速度比吸收肽和蛋白质要快[10-12]，导致由饲料来源的蛋白分解出的游离氨基酸利用效率降低，部分氨基酸分解作用加剧[13]。有关CAA在动物体内代谢程度的研究较少，Segovia-Quintero等通过饲喂尼罗罗非鱼含放射性35S的蛋氨酸结果表明，蛋氨酸在整个肠道都有吸收，在前肠吸收最高[14]。

蛋氨酸吸收入血最初在肝脏聚集，首先经MAT在ATP的作用下形成SAM，成为体内最重要的甲基供体并且参与多种细胞信号传递过程。本试验通过测定凡纳滨对虾养殖第28 d和第50 d时的MAT活性间接反映蛋氨酸的吸收速度和代谢程度。结果表明，养殖试验进行至第28 d和50 d时，摄食后的不同时间点凡纳滨对虾肝胰腺MAT活性是有差异的。28 d时摄食0.5 h时CAP组的MAT活性最高，并且几种蛋氨酸添加形式除了TPA微胶囊蛋氨酸组以外均高于MET组，提示晶体蛋氨酸是否在0.5 h内已经被吸收代谢，也就是说在0.5 h以内，由于晶体蛋氨酸进入消化道后以较高的底物浓度刺激了MAT的活性，使得该处理组在0.5 h时已经过了该酶活性的最高峰值；而微胶囊蛋氨酸的不同处理均具有一定的缓释作用，在0.5 h时CAP组MAT活性最高，已经有一定量蛋氨酸释放被吸收进入代谢途径，分析可能由于包被技术的原因使该处理组表现出蛋氨酸的突释，三种微胶囊蛋氨酸的制作工艺是不同的，包被的时间也不同，导致其释放的速度以及包被的效果存在差异[15]。1 h时MET组活性上升提示蛋白结合态中的蛋氨酸可能已经分解游离出来，通过肠道黏膜吸收而使MAT活性上升；第50 d时0.5 h，MET和MHA处理组的MAT活性较高，提示蛋氨酸已经被吸收代谢，到1 h时三个微胶囊组的MAT活性开始上升，图2显示，CAP和TPA处理组微胶囊的蛋氨酸吸收可能快于RES组，RES组MAT活性逐渐上升，3 h时达最大，提示此时RES组的蛋氨酸吸收较高，可能与蛋白质结合态分解出的蛋氨酸同步，并被动物较好利用，积极参与了蛋氨酸的代谢过程。MET组在第28 d摄食后12 h MAT活性最高，在第50 d摄食后6 h MAT活性最高（12 h样本损坏）提示可能在此时已经完成一个蛋氨酸循环并进入到下一个循环，而此时蛋氨酸浓度较高致使蛋氨酸形成SAM时MAT表现出较高的活性。

Segovia-Quintero等认为强饲尼罗罗非鱼含有MET和CAP蛋氨酸的饲料后，肝脏35S的活性在1 h和6 h时显著增高，并且一直保持到12 h，TPA处理组肝脏中35S放射活性在整个观察期内显著低于另外两个组，因此，认为TPA包被的蛋氨酸吸收速率低于晶体蛋氨酸和CAP包被的蛋氨酸，TPA的缓释效果好于CAP[14]；本试验中第28 d的结果显示，微胶囊处理的三个蛋氨酸组在12 h的MAT活性均有下降，MET组的MAT活性高于微胶囊处理的三个蛋氨酸组，以RES组最低，这和前者结果相似；第50 d时12 h的样本损坏，未能获得此时的结果。

4 小结

本试验条件下的数据表明，生长过程中的不同时期，凡纳滨对虾对氨基酸的吸收是存在差异的，微胶囊化对晶体蛋氨酸的吸收有一定的缓释作用，可以改善晶体蛋氨酸和蛋白质结合态蛋氨酸的吸收效率。需要进一步优化蛋氨酸的微胶囊壁材、包被工艺和了解凡纳滨对虾机体蛋氨酸的代谢动力学，在提高蛋氨酸吸收的基础上改善其代谢效率。

[1]Fox J M,Lawrence A L,Li-Chan E.Dietary requirement for ly⁃sine by juvenile Penaeus vannamei using intact and free amino ac⁃id sources[J].Aquaculture,1995,131:279-290.

[2]Teshima S,Kanazawa A,Yamashita M.Dietary value of several proteins and supplemental amino acids for larvae of the prawn(Penaeus japonicus)[J].Aquaculture,1986,51:225-235.

[3]El-dahhar A A,El-shazly K.Effect of essential amino acids(me⁃thionine and lysine)and treated oil in fish diet on growth perfor⁃mance and feed utilization of Nile tilipia,Tilapia nilotica(L.)[J].Aquac Fish Manag,1993,24:731-739.

[4]Viola S,Angeoni H,Lahav E.Present limits of protein sparing by amino acid supplementation of practical carp and tilapia feeds[J].J.Aquac-Bamidgeh,1994,46:203-211.

[5]Kaushik S J,Luquet P.Influence of bacterial protein incorpora⁃tion and of sulphur amino acid supplementation to such diets on growth of rainbow trout[J].Aquaculture,1980,19:163-175.

[6]Zarate D D,Lovell R T.Free lysine（L-lysine·HCl）is utilized for growth less efficiently than protein-bound lysine(soybean meal)in practical diets by young channel catfish(Ictalurus punctatus)[J].Aquaculture,1997,159:87-100.

[7]Li M H,Robinson E H.Effects of supplemental lysine and methio⁃nine in low protein diets on weight gain and body composition of young channel catfish Ictalurus punctatus[J].Aquaculture,1998,163:295-305.

[8]Chen B A,Leng X J,Li X Q,et al.Study on the effect of crystal⁃line or coated amino acid for cyprinus carpio[J].Acta hydrobiologi⁃ca sinica,2008,32:774-778.

[9]Williams K,Barlow C,Rodgers L.Efficacy of crystalline and pro⁃tein-bound amino acid enrichment of diets for barramundi/Asian seabass(Lates calcarifer Bloch)[J].Aquacult.Res.,2001,32(Suppl.1):415-429.

[10]Rojas-García C R,Rønnestad I.Assimilation of dietary free ami⁃no acids,peptides and protein in postlarval Atlantic halibut(Hip⁃poglossus hippoglossus)[J].Mar.Biol.,2003,142:801-808.

[11]Rønnestad I,Conceição L E C,Aragão C,et al.Assimilation and catabolism of dispensable and indispensable free amino acids in post-larval Senegal sole(Solea senegalensis)[J].Comp.Biochem.Physiol C.2001,130:461-466.

[12]Rønnestad I,Conceição L E C,Aragão C,et al.Free amino ac⁃ids are absorbed faster and assimilated more efficiently than pro⁃tein in postlarval Senegal sole(Solea senegalensis)[J].J.Nutr.,2000,130:2809-2812.

[13]Lovell T.Nutrition of aquaculture species[J].J.Anim.Sci.,1991,69:4193-4200.

[14]Segovia-Quintero M A,Reigh R C.Coating crystalline methio⁃nine with tripalmitin-polyvinyl alcohol slows its absorption in the intestine of Nile tilapia,Oreochromis niloticus[J].Aquacul⁃ture,2004,238:355-367.

[15]Chi S Y,Tan B P,Lin H Z,et al.Effects of supplementation of crystalline or coated methionine on growth performance and feed utilization of the pacific white shrimp,Litopenaeus vannamei[J].Aquac.Nutr.,2011,17:e1-e9.