OPN和MMP-9在结直肠癌中的表达及其与肝转移的相关性

杨丽君 陈钟

结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，其发病率在近年呈上升趋势。早期缺乏特异的临床表现，肿瘤的侵袭转移成为影响预后的主要因素。肝脏是结直肠癌血行转移的最主要的靶器官[1]，结直肠癌肝转移是治疗的重点和难点之一，也是患者最主要的死亡原因[2]。目前仍缺乏预测结直肠癌病人术后生存率的可靠指标。骨桥蛋白(OPN，osteopontin)是一种具有多种功能的分泌型钙结合磷酸化糖蛋白，与肿瘤细胞生长、增殖、侵袭和转移密切相关。基质金属蛋白酶-9（MMP-9，Matrix metallopmteinase-9）可降解细胞外基质和血管基底膜的蛋白酶，在肿瘤的侵袭、转移过程中起着关键性作用。但有关OPN和MMP-9在结直肠癌侵袭转移中相互作用及与结直肠癌肝转移相关性的研究尚少。本研究通过检测结直肠癌患者组织中OPN和MMP-9表达，探讨二者在结直肠癌发生、发展过程中的作用及与结直肠癌肝转移的相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 结肠、直肠癌组织取自肿瘤正中无坏死部分，约3mm×3mm大小，正常结直肠粘膜组织取自距肿瘤边缘5cm以外结肠、直肠粘膜上皮，约3mm×3mm大小。标本取自常州第七人民医院、南通大学附属医院2008年5月至2011年7月结直肠癌外科手术标本，病例资料完整，年龄40～80岁。结直肠癌60例，术后病理组织学类型确诊为腺癌(男32例，女28例；结肠癌22例，直肠癌38例；分化程度：高分化13例、中分化32例，低分化15例；肿瘤大小(直径)：＜5cm，31例，≥5cm，29例；无肝转移30例，有肝转移30例；Dukes分期A+B期28例，C+D期32例)。12例正常肠粘膜来自手术切除距肿瘤组织5cm以上结肠、直肠粘膜及非肿瘤病人的结肠、直肠粘膜手术切除标本。肝转移诊断主要依据B超、CT、剖腹探查及病理，所有病例术前均未行放、化疗。

主要试剂：MMP-9 鼠抗人单克隆抗体SC-80205、OPN鼠抗人单克隆抗体 SC-21742等。

1.2 方法 采用LAB VISION 2D全自动免疫组化染色仪，免疫组化PV-9000二步法进行染色。

1.3 结果判断 采用双盲法，阳性表达的判断按照Volm的标准。按着色细胞百分数计分,＜20%为0分,≥20%～＜50%为1分,≥50%为2分。按着色强度计分,无着色为0分,淡黄色颗粒为1分,棕黄色颗粒为2分。将着色细胞百分数计分与着色强度计分相乘,总计分0分为阴性(-),1～2分为弱阳性(+),4分为强阳性(++)。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对实验数据进行统计学处理，各检测指标与病理参数率的比较采用χ2检验和连续校正χ2检验。肝转移的相关性采用Spearman相关性检验。取α=0.05为检验水准。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 OPN、MMP-9的表达 OPN、MMP-9在结直肠癌组织中阳性表达率分别为71.6% (43/60)、68.3%(41/60)，在正常粘膜上皮组织中弱表达分别为16.7%(1/12)、0%(0/12)。结直肠癌组和正常粘膜组中OPN、MMP-9的表达情况相互比较差异有统计学意义(P＜0.05)（见表1）。OPN、MMP-9在结直肠癌肝转移组阳性表达率分别为83.3%(25/30)、83.3%(25/30)，结直肠癌无肝转移组阳性表达率分别为60.0%(18/30)、53.3%(16/30)，结直肠癌肝转移组和无肝转移组中OPN、MMP-9的表达情况相互比较差异有统计学意义(P＜0.05)（见表2）。OPN、MMP-9在各种组织的阳性表达情况见图1、图2。

表1 正常组织、结直肠癌组织中OPN、MMP-9表达阳性率对比

表2 结直肠癌有无肝转移分组中OPN、MMP-9表达阳性率对比

表3 结直肠癌组织中OPN、MMP-9表达与临床病理特征的关系(例)

2.2 OPN、MMP-9的表达与结直肠癌临床病理特征的关系 OPN、MMP-9在结直肠癌的表达与患者的年龄、性别、部位及肿瘤大小、分化程度无明显相关性(P＞0.05)。OPN、MMP-9在有肝转移组、Dukes C+D期组中的阳性表达率均高于相应对照组，且差异有统计学意义(P＜0.05),60例结直肠癌中MMP-9的表达水平同肿瘤的分化程度的相关性有统计学意义(P＜0.05)；（见表3）。

图1 OPN在正常结肠直肠上皮组织(A)结直肠癌组织（B）中表达(DAB,×400)

图2 MMP-9在正常结肠直肠上皮组织(A)结直肠癌组织（B）中表达(DAB,×400)

2.3 OPN、MMP-9蛋白阳性表达的相关性分析 分别观察OPN和MMP-9蛋白在同一标本中的表达情况。在共60例结直肠癌标本中，OPN和MMP-9表达共同阳性为37例(61.67%)，共同阴性为9例(15%)，二者单独阳性分别为8例和6例，相关分析表明在结直肠癌发展过程中OPN和MMP-9蛋白表达呈显著正相关(r=0.447，P=0.001，P＜0.05),如表4所示。

表4 OPN与MMP-9蛋白阳性表达的相关性

3 讨论

OPN是最先从骨基质中分离得到一种糖蛋白，它可以抑制细胞凋亡、促进细胞黏附、参与免疫逃避、促进新生血管形成等[3]。OPN的一级结构中的RGD序列是一种粘附基序，在OPN与其主要受体avl33，CD44的结合、增强细胞与基质、细胞与细胞的粘附、介导细胞的移行中起重要作用[4]。近年来研究发现OPN与肿瘤细胞生长、增殖和侵袭、转移密切相关[5]。Brown等发现OPN主要位于肿瘤浸润的前沿，OPN在细胞的表达部位随肿瘤恶性化发展的改变，分化差的结直肠癌OPN主要集中于与细胞外基质交界的肿瘤细胞的基底面，分化好的结直肠癌OPN主要位于肿瘤细胞的顶部表面，与正常结直肠上皮细胞的定位相似，这提示OPN在肿瘤的转移和浸润过程中具有重要作用。丁凌等[6]研究表明，在肝脏中存在OPN的受体整合素和CD44v6的阳性表达，使得分泌OPN的结直肠癌细胞得以在肝脏中滞留。在转移的发生发展进程中，涉及了一系列酶-酶，配体-受体，蛋白-蛋白之间的相互作用,OPN与其受体之间相互作用及OPN对结直肠癌细胞同质异质粘附的影响，可能是结直肠癌肝转移的一个重要的环节，在结直肠癌肝转移的启动和发展过程中可能都起着极其重要的作用。本研究发现，OPN阳性表达区域主要位于细胞质，周围基质中少数炎症细胞及血管内皮细胞胞质中也有表达。OPN的表达与患者的年龄、性别、肿瘤的浸润深度、肿瘤直径无关，与Dukes分期及有无肝转移有关。OPN在结直肠癌肝转移组、Dukes C+D组呈高表达，与相应对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，OPN在正常肠黏膜组织、结直肠癌组织中的表达率有显著差异，提示OPN可能在结直肠癌的发生、浸润和结直肠癌肝转移方面扮演重要角色。

基质金属蛋白酶(MMPs)是一大类具有降解细胞外基质成分功能的蛋白酶，从而促进肿瘤浸润，导致不良预后。最新的研究表明MMPs在肿瘤进展中的作用还包括参与增殖、凋亡和细胞分化。MMPS可以与很广泛的非基质蛋白相互作用，包括生长因子、生长因子受体、细胞黏附分子、趋化因子、调节凋亡蛋白、其它蛋白酶和凝血因子[7-9]。一些MMPs可以被一些关键的癌基因和抑癌基因在转录水平激活，参与结直肠癌的癌变。很多研究表明MMPS表达的增强或活性增加与结直肠癌预后有关[10]。MMP-9的主要底物均为IV/V型胶原。Ⅳ型胶原为基底膜中结构蛋白，对维持基底膜的完整性至关重要。由于Ⅳ型胶原独特的螺旋结构，因此大部分蛋白酶对其无降解作用，但MMP-9可以降解Ⅳ型胶原和层粘连蛋白等成分，破坏基底膜的完整性，这是肿瘤浸润和转移的先决条件。本研究提示，MMP-9阳性颗粒主要位于肿瘤细胞的胞质内，基质内少数血管内皮细胞染色阳性，细胞外基质中的阳性表达，说明肿瘤细胞和基质细胞的相互协同作用，形成肿瘤侵袭转移的微环境。此外，MMP-9阳性表达的组织基底膜不完整，甚至部分基底膜有缺损或断裂。MMP-9的表达与患者的年龄、性别、肿瘤的浸润深度、肿瘤直径无关，与Dukes分期、分化程度及有无肝转移有关。MMP-9在正常肠黏膜组织、结直肠癌组织中的表达率的显著差异有统计学意义,结直肠癌肝转移组和无肝转移组中基质金属蛋白酶-9的表达情况相互比较差异有统计学意义(P＜0.05)。提示MMP-9可能参与结肠直肠癌的发生、发展结肠直肠癌侵袭肝转移过程有关，其可能成为结肠直肠癌预后判断的参考指标。

MMP-9的表达受体内外许多调节因子的影响，整合蛋白就可以加强它的功能。整合蛋白通过RGD位点与已经被基质金属蛋白酶水解的胶原相结合，使肿瘤细胞ανβ3受体表达增强，从而提高肿瘤细胞的浸润和转移的能力。研究已经证实OPN通过与整合素ανβ3受体的结合，可以提高MMP-9的表达和激活、细胞的迁移、基质细胞的浸润，从而导致肿瘤的形成。Rangaswami应用B16F10细胞株研究发现，OPN可激活NIK并增强其调控uPA分泌和uPA依赖性蛋白pro-MMP-9的活化，故OPN可能在肿瘤早期侵袭转移中起着重要的调控作用[11]。此外，OPN和MMP-9也可能通过旁分泌效应改变周围基质的微环境，如促进肿瘤血管形成等，以利于肿瘤向远处转移。本研究发现，OPN和MMP-9的表达呈显著正相关(r=0.405，P=0.002，P＜O.05)，OPN表达增加可能使得MMP-9表达上调。因此推测，OPN和MMP-9在结直肠癌的发生、发展过程中可能具有协同作用。

综上所述，本研究验证了OPN和MMP-9在结直肠癌及其肝转移中的高表达，提示OPN和MMP-9与结直肠癌的发生、浸润、肝转移密切相关，同时检测二者的表达情况有可能为结直肠癌的早期诊断及判断预后提供重要依据。

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