定量检测血浆EBV-DNA在鼻咽癌诊治中的临床研究

王雪英

鼻咽癌(NPC)在我国的发病率较高，多发于我国南方。而Espstein-barr病毒属于疱疹病毒科ɣ亚科，已有研究发现EB病毒与鼻咽癌发病密切相关[1],鼻咽癌患者EB病毒感染率明显高于健康人群。过去常常利用检测EB病毒的相关抗体来对鼻咽癌患者实施诊断及对病情变化检测，但这种方法特异性和敏感性较差。随着PCR技术的不断发展，使直接对EBV定量检测在临床中得以实现，且已被广泛使用。因此，本研究为探讨定量检测血浆EBV-DNA在鼻咽癌诊治中的临床意义，现将具体情况报告如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2011年1月～2011年12月在经我院病理检查初诊为鼻咽癌患者320例，其中男180例，女140例；年龄最大71岁，最小24岁，平均44.2岁；病理类型：泡状核癌30例，中分化鳞癌75例，低分化鳞癌215例。健康体检者290例,男155例,女135例,平均年龄39.4(26～63)。标本采集:分别抽取3组受检者外周血2ml,加入EDTA抗凝管,4000r／min离心,然后吸取上层血浆于-20℃保存待测。

1.2 研究方法 采用荧光定量PCR法血浆检测EBVDNA含量。实时荧光定量PCR仪为德国Roche公司生产的LightCyclerⅡ,标本严格按中山大学达安基因股份有限公司生产的EB病毒(EBV)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒说明书进行操作,荧光定量PCR反应体系包括：PCR缓冲50μl，上下游引物和探针各10pmol，dNTP、dCTP、dGTP、dUrP各200pmol／L,Taq聚合酶5μl模板5μl。双标记荧光探针序列5′-(FAM)CTGTCT GTAAAGTCCAGCCTCC(TAMRA)-3′,每批PCR均用双蒸水作阴性对照；克隆合成的EB病毒DNA片段作为阳性对照，并稀释成不同浓度梯度进行PCR扩增。先将荧光定量PCR扩增仪在93℃3min预变性，然后接93℃45s，55℃2min，40个循环，反应结束，用计算机将样本和标准曲线对比计算。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件包对所有数据进行处理，用χ2检验比较计数资料，以均数±标准差（x±s）表示评分数据，采用t检验对计量资料进行组间显著性测试，将P≤0.05定为检验水准。

2 结果

2.1 3组EBV-DNA测定结果及其比较 治疗前组阳性率为92.5%,治疗后组均经随访鼻内镜活检和病理证实为NPC放疗后复发阳性率为23.4%；健康对照组阳性率为3.4%；3组间阳性率比较差异有统计学意义（P＜0.05）具体结果见下表1。

表1 对照组和治疗前后组血浆EVB-DNA检测结果比较

2.2 血浆EBV-DNA水平和鼻咽癌严重程度的关系 在经我院病理诊断为鼻咽癌的320例患者中，有淋巴转移的201例，无淋巴转移119例，在有无淋巴结转移组间比较，血浆EVB-DNA检测阳性率差异具有统计学意义（P＜0.05）。具体结果见下表2。

表2 鼻咽癌有无淋巴结转移组间检测结果比较

3 讨论

EB病毒是嗜淋巴细胞的疱疹病毒,属DNA肿瘤病毒,该种病毒能引起人类的传染性单核细胞增多症,还和T淋巴细胞瘤、类风湿性关节炎、鼻咽癌等有关,也可终身潜伏体内[2]。虽然不能直接肯定EB病毒就是导致鼻咽癌的病因,但大量科学研究已经发现,在几乎所有的鼻咽癌细胞中存在EB病毒,在鼻咽癌细胞DNA中可以找到被整合的EBV特异性基因片段,说明EB病毒感染和鼻咽癌有密切关系。目前，临床上鼻咽癌患者治疗前诊断、疗效监测、局部复发或转移的诊断，主要依靠影像学检查，但影像学检查价格比较昂贵，且有时对疗效判断、诊断复发或转移时敏感性较差。主要原因是因为一方面，CT、MRI等是一种局部显像技术，不可能同时检测到每一个可能发生转移的部位；另一方面，传统的影像学检查在诊断较小的转移处、放疗后肿瘤浸润与纤维化鉴别时，以及残存肿瘤性质的判断方面具有一定的局限性[3]。

随着核酸分子杂交及PCR技术的发展,特别是荧光基因探针（FQ-PCR）技术在临床的应用,为人们研究NPC的病因和诊断方法提供了新的手段。FQ-PCR技术具有高特异、高灵敏、有效防止污染的优点,用于检测病原微生物感染比免疫学方法检测抗原和抗体更直接、更准确[4]。EBV-DNA拷贝数是患者体内的EB病毒数量。若患者体内病毒拷贝数高,就预示着该患者病情较为严重[5-6]。本研究通过荧光PCR对鼻咽癌患者治疗前后以及健康体检者的血浆EBV-DNA含量进行定量检测，发现治疗前组患者血浆EBV-DNA阳性率为92.5%明显高于治疗后组（23.4%）和健康对照组（3.4%），P＜0.05。治疗后组的阳性病例均出现鼻咽癌复发，阴性病例没有复发。在有无淋巴转移组间比较，有淋巴转移组的血浆EBV-DNA阳性率明显高于无淋巴转移组（P＜0.05）。这说明鼻咽癌与EB病毒感染密切相关。

总而言之，血浆EBV-DNA水平对鼻咽癌的诊断具有重要意义，同时有可能成为监测鼻咽癌患者放疗后复发、转移的肿瘤标记物在鼻咽癌的治疗中起重要作用。

[1]李多杰,彭开桂,江浩,等.血浆EBV-DNA定量分析在监测鼻咽癌患者复发和转移中的价值[J].实用肿瘤杂志,2008,23(1):12-15.

[2]李群.EB病毒VCA2IgA和EA2IgA抗体与鼻咽癌诊断的关系[J].海南医学院学报,2007,13(2):180.

[3]杨德辉.鼻咽癌患者血浆游离EBV-DNA检测的研究现状[J].中山大学研究生学刊,2006,26(1):1-5.

[4]曾刚毅,唐孝亮,钟海军.实时荧光定量PCR法检测鼻咽癌患者血浆游EB病毒DNA的临床应用[J].检验医学与临床,2008,5(10):591.

[5]冯海燕,莫颖禧,周晓莹,等.鼻咽癌患者血浆EB病毒DNA水平与肿瘤的分期关系[J].临床耳鼻咽喉头颈外颈外科杂志,2008,22(5):277-278.

[6]熊春娥.鼻咽癌放疗的治疗及护理体会[J].当代医学,2009,15(3):126-127.