探讨PNA-FISH在组织石蜡切片中应用的技术要点

代蕾颖,胡 军,吕 瑛

(北京金菩嘉医疗科技有限公司，北京 100176)

20世纪80年代末，起源于放射性杂交的荧光原位杂交 (FISH)技术开始建立。20多年来，这项技术已经得到了长足的发展，大量商业化探针的出现更使其广泛应用于临床诊断。随着FISH新技术的出现，探针的种类也不断增加，肽核酸探针就是其中一种。肽核酸(Peptide Nucleic Acid，PNA)是一类具有类多肽骨架的DNA类似物，它是不带电荷的分子，避免了寡核苷酸与其靶序列结合时因电荷相互排斥所导致的杂交不稳定性，且PNA与靶序列的结合不易受杂交液离子强度的影响，从而显示出其极强的杂交优势，大大提高了检测灵敏度[1]。PNA-FISH技术适用于多种标本类型，特别是档案标本，如福尔马林固定石蜡包埋的组织。

1 材料与方法

1.1 材料 福尔马林固定石蜡包埋的组织，标记荧光素的PNA探针。

1.2 方法 石蜡组织切片经二甲苯脱蜡后用0.2 mol/L HCL和20μg/ml蛋白酶去除组织自身荧光背景，经过预处理的样本加入标记荧光素的PNA探针，盖上盖玻片，用封片胶封住边缘，放于预热到杂交温度的湿盒内,置于培养箱内杂交90分钟。去掉盖玻片，于预热到杂交温度的洗脱液中洗脱30分钟。样本自然晾干后加入含有DAPI的抗淬灭剂后，在荧光显微镜下进行观察。

2 结果

用PNA探针，对经过预处理的石蜡组织切片不经过高温变性，只经过90分钟55℃杂交，探针可以透过细菌的细胞壁得到信号。通常石蜡组织切片通过常规染色后定位目标区域，然后再在荧光显微镜下找到FISH玻片相对应的目标区域观察。在观察之前应该先了解信号的理论分布区域、形态(如DNA处于细胞核内，RNA 处于胞浆内，微生物则有其固有形态)。过于锐利的、不规则的荧光信号一般为杂质。选择多个观察视野，条件允许的情况下对所有目标区域进行观察。

为得到更好的实验结果，本研究分别通过标本制备、标本预处理、杂交、洗脱和结果观察，对PNA-FISH 在石蜡切片样本中的应用技术要点进行探讨并比较了PNA-FISH与普通的DNA-FISH在多个方面的不同，见附表。

附表 PNA-FISH与DNA-FISH的比较

3 讨论

因肽核酸本身的特性，PNA-FISH与普通的DNAFISH相比具有敏感性高、特异性强、周期短、操作简便、标记的探针可长期保存等特点。通常PNA探针都是人工合成的短序列，对于重复序列如着丝粒特异性的alphoid DNA、简单卫星DNA 和Alu家族，PNA-FISH技术都是很好的选择[2]。除此之外PNA探针相对更疏水，使得PNA可以在不破坏细胞形态的情况下更易扩散透过细菌的细胞壁，所以特别适合检测不能培养或生长缓慢的微生物。

据报道，超过10年的石蜡包埋组织都可以检测RNA[3]从理论上说，长时间的石蜡组织只要保存得当，都可以做FISH实验。实验前将石蜡组织切片固定在涂有多聚甲醛或多聚赖氨酸的载玻片上，56℃过夜即可。

如果样本固定不充分导致核酸降解，不管后期怎么优化实验条件，这例样本均不能得到准确完整的PNA-FISH实验结果。所以临床上取得的新鲜组织要立即用中性福尔马林固定，固定时间一般为24小时- 48小时。较大的组织标本要剖开，保证组织各个部分都充分固定，避免DNA和RNA被降解，这是做组织切片FISH的前提条件。

石蜡组织切片在做PNA-FISH 前需要做脱蜡、蛋白酶消化去背景等步骤。因为本身PNA探针的穿透性强，所以预处理的主要目的是降低背景自发荧光和去除杂质干扰信号。

二甲苯脱蜡前用烤片机65℃烤玻片使蜡熔化有利于完全脱蜡。有些实验室为了实验人员的安全使用二甲苯取代剂，按照产品说明处理后的石蜡组织切片也可以做PNAFISH。

通常组织切片用蛋白酶来降低背景荧光，提高信号强度。胃蛋白酶较为温和，而蛋白酶K活性则要强的多。难消化的样品可以用盐酸和异硫氰酸盐处理，从而破坏交联的组蛋白键，提高随后的酶消化效率。

优化组织背景的酶消化处理条件对实验成功尤为重要消化不够则自发荧光高，消化过度会减弱信号。所以在开展PNA-FISH实验前要对此种组织的石蜡切片做条件优化，选择合适的条件以供后面的批量化实验。

因为PNA的无电荷骨架以及疏水特性，PNA探针有相对于DNA探针的更高的结合亲和力和快速杂交动力学，不需要对双链DNA进行变性解链或打开RNA的高级结构，只需要大约90分钟较高温度的杂交就可充分杂交。杂交温度根据熔解温度(Tm)的高低来确定，Tm值高，杂交温度高;Tm值低，杂交温度低。常见的PNA-FISH杂交温度一般为55℃和60℃。

PNA是不带电荷的中性分子，所以PNA-DNA(或RNA杂交形成的双链结构由于缺少电荷的排斥作用使解链温度增加，从而提高了PNA-DNA(或RNA)杂交体的热稳定性[4]所以在较高的洗脱温度下进行洗脱，一般为杂交温度下，浸泡30min，期间可以适当震荡玻片使洗涤更充分。

综上所述，PNA-FISH虽然具有技术快速、准确、操作简便等特点，但是在组织石蜡切片样本中还是应该关注一下要点:组织样本的固定是基础，组织酶消化是实验结果成败的关键，选择合适的杂交和洗脱温度，尽量扩大观察视野。

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