高效液相色谱与共振散射光联用方法测定家兔血浆中阿米卡星的含量＊

周 卿，周旭美，杨 杰，陈芳路

(1.遵义医学院 药学院药物分析教研室，贵州 遵义 563099;2.遵义医学院 药学院08级学生，贵州 遵义563099)

阿米卡星(amikacin，AMK)是易溶于水的第三代半合成氨基糖苷类抗生素，具抗感染作用，是临床常用强效广谱抗生素。它的优点在于耐药性低和抗菌效率高，但其具有一定的肾毒性和耳毒性，临床上应用时应尽可能进行血药浓度监测。但阿米卡星无特征紫外吸收基团，文献［1～4］多采用微生物法、经柱前衍生的高效液相色谱法或HPLCELSD 方法，目前也有报道采用 HPLC － RSL［5，6］联用方法检测阿米卡星制剂中的含量，但体内样品研究未有报道，本论文研究采用HPLC－RSL联用方法检测家兔血浆中阿米卡星的含量，方法灵敏度高，选择性好，专属性强，适用于阿米卡星在生物体内药物浓度的检测。

1 仪器与试剂

Agilent 1100全自动高效液相色谱仪(包括G1311A四元泵，G1311A四元泵，G1321A荧光检测器，美国安捷伦公司)，VARIAN Cary Eclipse荧光分光光度计(美国瓦里安公司)，TGL16M台式高速冷冻离心机(长沙迈佳森仪器设备有限公司)，家兔购于遵义医学院动物饲养中心。

阿米卡星标准品(批号:130335－200204，中国药品生物制品检定所)，阿米卡星注射液(天津药业焦作有限公司)，达旦黄(国药集团化学试剂厂)，甲醇和乙腈均为色谱纯(德国迪玛有限公司)，其他试剂为分析纯，实验所用水为重蒸水。

2 方法

2.1 HPLC－RSL联用方法原理及装置 在普通荧光分光光度计上测定分析物和探针溶液所形成离子缔合物的共振散射光光谱，确定共振波长。样品的分离在高效液相色谱仪上完成，另增加一个高压泵用于在色谱柱后输入探针溶液，被分离后的样品溶液和探针溶液在柱后三通阀中混匀后进入反应管，发生离子缔合反应，产生的RSL光谱由荧光检测器在线检测。

2.2 色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX SBC18(4.6 ×250 mm，5 μm)，流动相为水:乙腈 =97∶3(V/V)，流速为 0.5 mL/min，λex= λem=488 nm，柱温为25.0℃;探针达旦黄为20 μg/mL 的BR溶液(pH=4.56)，探针流速为 0.21 mL/min，柱后反应管长为150 cm，内径为0.5 mm。

2.3 溶液的配制

2.3.1 BR 缓冲溶液的配制 BR(Britton－Robison)缓冲溶液由0.02mol/mLNaOH溶液与0.04 mol/mL硼酸，磷酸，冰乙酸溶液按一定比例混合，配成pH=4.56的缓冲溶液。

2.3.2 标准溶液的配制精密称取阿米卡星标准品10.0 mg，用重蒸水溶解定容至10 mL的容量瓶中，得到浓度为1.0 mg/mL的储备液，并于4℃的冰箱中保存，临用前用BR缓冲液稀释至所需浓度。

2.3.3 TY－BR溶液的配制 精密称取达旦黄(Titan Yellow，TY)0.0100g，用 BR 缓冲溶液定容至500mL的容量瓶中，得到达旦黄浓度为20μg/mL的BR溶液。

2.4 血浆样品预处理方法 家兔经颈静脉取血1 mL于加入抗凝剂的采血管中，低速离心10 min(3500 r/min)，移取500μl上清液于空白离心管中，加入等体积乙腈，涡旋混匀，高速离心10 min(12 000 r/min，4℃)，取上层清液经N2气吹干后，用500 μlBR 缓冲液溶解，经 0.45 μm 滤膜过滤后进样 20 μl。

3 结果

3.1 方法专属性 空白血浆、阿米卡星加空白血浆、家兔服药后血浆经“2.4”项下方法处理后进样分析得到的色谱图见图1。在选定的色谱条件下，阿米卡星的保留时间约为4.2 min，血浆中内源性杂质对测定无干扰。

3.2 线性关系及定量限 分别于0.5 mL兔空白血浆中加入不同量的阿米卡星标准溶液，按“血浆样品预处理”项处理，以峰面积Y对血浆浓度C进行线性回归。线性方程为Y=3.02×c+42.16，r=0.9992，结果表明，阿米卡星血浆浓度在10～600 μg/mL范围内，线性关系良好。血浆样品可进行定量检测的最低浓度为5.0 μg/mL(S/N=3)。

3.3 回收率和精密度试验 提取回收率:配制含阿米卡星高、中、低3 种浓度为 50、250、500 μg/mL血浆样品各5份，按2.4项下方法操作，进样20 μl;另配制相同浓度的阿米卡星标准溶液，按相同量进样，分别记录峰面积，以血浆样品测定峰面积与标准溶液的峰面积的比值计算提取回收率，结果均在90%以上，结果(见表1)。

3.4 相对回收率及精密度 配制含阿米卡星高、中、低 3 种浓度为 50、250、500 μg/mL 血浆样品各5份，按2.4项下方法操作，分别在同1 d内测定5次，按回归方程计算浓度。以测定值与加入值的比值计算相对回收率，并计算日内精密度，对上述样品连续测定5d，考察方法日间精密度，结果相对回收率在90%以上，日内日间变异系数小于10%，结果(见表1)。

表1 血浆中阿米卡星的回收率和精密度(±s，n=5)

表1 血浆中阿米卡星的回收率和精密度(±s，n=5)

C/μg·mL－1 Intra－day RSD/% Intra－day RSD/% Method recov 90.3 ±2.54 250 235.51 ±2.15 2.1 230.1 ±6.28 2.72 93.1 ±1.97 93.6 ±1.87 500 499.27 ±0.14 1.6 498.9 ±0.98 0.19 99.8 ±0.19 eries/% Extraction recoverier/%50 54.64 ±3.37 3.7 58.78 ±2.64 4.49 107.7 ±4.10 97.6 ±2.24

3.5 稳定性试验 用空白血浆配制含阿米卡星浓度为250 μg/mL的血浆样品，在－20℃冰箱中放置，分别在0、4、8、12、16、20d 取样，按上述方法测定，计算阿米卡星的浓度，结果样品在冷冻条件下放置20d内稳定，RSD为4.67%。

3.6 方法应用 取家兔5只，分别于实验前禁食12 h，注射剂量按体重换算为12.5 mg/kg，耳缘静脉给药，颈静脉取血，依次按10 min、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h 各取血 1 mL 于加入抗凝剂的采血管中，按2.4项下方法处理，测定阿米卡星在兔血浆中的浓度，绘制平均血药浓度－时间曲线，(见图2)。结果经3P97药动学软件计算出主要药代动力学参数。结果显示，家兔1次静脉注射阿米卡星后的药时曲线为二室模型，生物半衰期为 t1/2为1.11±0.308 h，曲线下面积 AUC 为1193.4 μg/mL·h，与文献报道基本相符［5］。

图2 兔血浆中阿米卡星的平均药－时曲线(n=5)

3.7 TY－AMK的RSL光谱 由图3可见，在一定酸度条件下，AMK与TY本身RSL很弱。AMK与TY形成离子缔合物后，增强了RSL强度。最大峰位于λex=λem=488nm处，且随着浓度的增大，AMK的浓度与RSL的强度呈一定的线性关系，可作为定量的依据。

图3 AMK－TY体系的共振散射光谱图

4 讨论

4.1 RSL实验条件的选择 在考察AMK－TY的RSL体系时，体系酸度是重要的影响因素。实验中，通过改变BR缓冲溶液的pH值来调节体系的酸度，考察了pH值在3.0～6.0范围内，AMK－TY形成离子缔合物的共振光强度随pH值的变化情况，结果显示pH值在4.56～5.50范围内可产生较强的RSL强度，当酸度过高时(pH≤4.0)，抑制了TY上－SO3H基团上H的离解，不利于离子缔合反应;而当酸度过低时(pH≥7.0)，由于AMK质子化的H+离解，而使它的正电荷降低，也不利于离子缔合物的形成，使得 RLS的强度减小［7］。此外考虑到样品在进入HPLC后由于柱后反应管长及流速的限制，AMK须与探针试剂在短时间内形成稳定的离子缔合物，故在此部分实验中，还考察了TY与AMK反应时间及稳定性，结果显示AMK－TY可迅速反应，稳定时间1 h以上，可满足HPLC－RSL方法的要求。

4.2 HPLC－RSL条件的优化

4.2.1 流动相的选择 在选择流动相时，需充分考虑到在RSL反应中，由于离子缔合物具有较强的疏水性，从而与水形成界面，使得RSL强度显著增强，如果溶剂中含有高浓度的有机溶剂将使这一界面消失，导致RSL强度显著降低［8］，故在HPLC方法中选择流动相时需注意有机相的比例。实验中考察了甲醇 －水(1∶99 ～10∶90，v/v)，乙腈 － 水(1∶99 ～10∶90，v/v)两种流动相体系，结果显示采用甲醇－水作为流动相时，所得色谱峰峰形易展宽，基线呈锯齿状，噪音较大，而采用乙腈－水作为流动相时，色谱峰峰形良好，对称性好，且基线平稳，当乙腈－水比例为3∶97(V/V)时，AMK在5min内可被完全洗脱，故选择流动相为乙腈－水(3∶97，V/V)。

4.2.2 流速对RSL反应的影响在HPLC－RSL联用技术中，流速对RSL反应的影响有两种，一种是HPLC的流速;一种是探针的流速。HPLC的流速主要用于控制流动相携带样品在色谱柱上的作用行为，探针流速用于控制在色谱柱后加入的探针试剂的流速。流速过快，容易造成RSL反应时间不够，检测浓度过低，流速过慢，容易造成峰展宽，故需要调节适宜的流速。在实验中，调节流速时需同时兼顾两种流速对样品检测的影响，否则容易造成严重的基线波动，经实验考查，最终确定HPLC 流速为0.5mL/min，探针流速为 0.21 mL/min，此条件下，可得到平稳的基线及峰形良好的色谱峰。

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