Cx43蛋白的表达与不同类型肿瘤转移的相关性探讨＊

汪秋鸿，边 可，张素素，郭瑞珍，王海青

(遵义医学院珠海校区1.2008级临床医疗系，2.病理学教研室，广东 珠海 519041)

肿瘤转移是恶性肿瘤生物学特性的表现之一，针对同源性两种肿瘤转移率不同，和恶性肿瘤早期、晚期发生转移的几率不同等问题，本研究选用细胞间隙连接蛋白43(Cx43)，采用免疫组织化学方法，检测来源相同但转移能力却不同的皮肤基底细胞癌(basal cell carcinoma.BCC)和皮肤鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma.SCC)，检测乳腺癌有转移和无转移的肿瘤组织中Cx43蛋白的表达，探讨Cx43与上述肿瘤转移的相关性及生物学行为的异样。

1 材料与方法

1.1 受检标本 收集2008年8月至2010年12月遵义医学院第五附属医院病理科的外检石蜡包埋标本，连续4μm厚切片，每例4张，备用。常规HE染色，光镜观察，确诊。所有病例术前均未经放疗和(或)化疗。

1.1.1 皮肤 BCC和 SCC组 皮肤BCC 15例，男性6例，女性4例，年龄35～74岁，平均65岁，均发生在颜面部。SCC组10例，男6例，女4例;年龄17～83岁，平均62.50岁;下肢3例，头皮4例，耳周及面部各3例，上肢、颈部及腹部各1例。BCC组织学类型包括有表浅型基底细胞癌、结节型基底细胞癌和色素性基底细胞癌，SCC病例均为高分化的鳞状细胞癌。

1.1.2 乳腺癌组 25例，均为女性患者。其中无淋巴结转移13例，年龄36～72岁，平均50.4岁，左乳腺5例，右乳腺8例;有淋巴结转移12例，年龄40～47岁，平均43岁，左乳腺7例，右乳腺5例，均为同侧腋窝淋巴结转移。组织学类型包括有浸润性导管癌、导管内癌。

1.2 试剂 兔抗人Cx43多克隆抗体、S-P免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。

1.3 实验方法 Cx43的免疫组化染色(S-P法)，以子宫平滑肌组织为阳性对照，以PBS代替一抗作为空白对照。切片常规脱蜡至水，微波抗原修复，操作步骤按试剂盒说明书进行，经DAB显色，苏木素复染，脱水干燥、透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.4 结果判断

1.4.1 阳性表达部位 DAB显色:CyclinA以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞，部分出现胞质阳性表达;CyclinA mRNA以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞;CyclinD1以细胞质/细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞。AEC显色:CyclinD1mRNA以细胞质/细胞核出现红色颗粒为阳性细胞。

1.4.2 阳性表达半定量积分法 根据每张切片的阳性细胞百分数和染色强度计分的乘积来判定［1］。每例切片在高倍镜(400倍)下随机取10个视野，计数100个细胞/视野，分别记录每个视野的阳性细胞数并计算其算术平均值，对阳性细胞所占百分比计分(＜5%=0分，5% ～25%=1分，26%～50%=2分，51% ～75%=3分，＞75%=4分);染色强度计分(无色=0分，淡黄色=1分，棕黄色=2分，棕褐色=3分);阳性表达评分标准以阳性细胞数和染色强度计分的乘积来判定，根据阳性细胞百分数和染色强度得分之积分为4个等级:0～2分为阴性(－)，3～5分为阳性(+)，6～8分为中度阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。≥6分为高表达，＜6分为低表达。

1.4.3 表达面积和灰度值 采用CCD成像结合图像分析系统在200倍光镜下，分析测定每个视野的阳性染色面积与分析区域面积比值、平均灰度值(灰度值越大，表明阳性细胞着色越深，蛋白表达强度越高)［2］。

1.5 统计学方法 运用SPSS 13.0统计软件包，数据以均数±标准差(±s)表示，然后进行单因素方差分析，以P＜0.05代表有统计学意义。

2 结果

2.1 Cx43蛋白在BCC和SCC中的表达 Cx43蛋白在BCC组织中呈阳性或弱阳性表达，在SCC中呈弱阳性或阴性表达(见图1)。BCC和SCC组织中Cx43蛋白的表达(表达水平、表达强度)有显著性差异(P＜0.01，见表 1)。

图1 基底细胞癌和鳞状细胞癌中Cx43蛋白的表达(IHC×400)

2.2 Cx43蛋白在乳腺癌组织中的表达 Cx43在无淋巴结转移的乳腺癌组织中呈阳性或弱阳性表达，在有淋巴结转移乳腺癌组织中呈弱阳性或阴性表达(见图2)，无转移组的表达明显高于有转移组，差异有统计学意义(P＜0.01，见表1)。

图2 无转移乳腺癌和有转移乳腺癌中Cx43蛋白的表达(IHC×400)

表1 各组组织中Cx43蛋白的表达(±s)

表1 各组组织中Cx43蛋白的表达(±s)

注:PA:代表阳性面积/分析区域面积;OD:代表光密度。

组 别 n Cx43蛋白的表达PA OD P BCC组SCC组15 10 0.805 ±0.051 0.101 ±0.024 0.52 ±0.061 0.31 ±0.031＜0.01乳腺癌(无转移)乳腺癌(有转移)13 12 0.803 ±0.042 0.121 ±0.026 0.34 ±0.023 0.28 ±0.031＜0.01

3 讨论

恶性肿瘤的侵袭转移是一个十分复杂的生物学过程，而其侵袭转移潜能的高低受多方面因素的影响。Cx43是人体内一种主要的细胞间隙连接蛋白，是近年发现的新的肿瘤抑制基因［3］，Cx43基因表达异常及其导致的细胞间隙连接通讯(gap junctional intercellular communication.GJIC)功能改变与多种肿瘤的发生关系密切，GJIC功能降低与肿瘤的转移有关［4，5］。本组通过检测Cx43蛋白在BCC、SCC、有转移和无转移的乳腺癌组织中的表达，获得有意义的结果。

BCC和SCC均由皮肤表皮发生，所以称之为同源性皮肤恶性肿瘤，但在临床上，两种肿瘤的生物学行为却完全不一样。BCC具有生长缓慢、对局部组织破坏性、侵袭性很强，却极少发生转移的特殊生物学行为，是所有恶性肿瘤中唯一几乎不发生转移的恶性肿瘤。而SCC病变发展较快，具有很强的浸润转移能力，其转移明显高于BCC。目前，关于BCC特有生物学行为相关方面的研究，越来越受到人们的关注和重视。但是，Cx43与皮肤恶性肿瘤的相关性研究报道却较少。2010年郭瑞珍报道［6］Cx43在皮肤表皮、皮肤瘢痕上皮和瘢痕癌组织中的表达，发现Cx43及其mRNA在皮肤表皮、皮肤瘢痕上皮和瘢痕癌组织中的表达逐渐降低，而且两两比较有统计学意义，我们认为与正常皮肤表皮比较，Cx43及其mRNA的低表达，与瘢痕癌的发生有相关性，可能与瘢痕上皮癌变也有相关性。Cx43蛋白在BCC中的表达水平和表达强度均高于SCC组，差异有统计学意义(P＜0.01)，这种表达的差异，提示与SCC比较，BCC中Cx43蛋白高表达可能与其生长缓慢及极少转移的生物学特性有关，反之，其低表达可能与SCC的发生和易出现转移有相关性。在BCC中，Cx43的转移抑制作用可能占有重要地位，发挥了更大的作用。因此，不同转移潜能的肿瘤组织中，Cx43蛋白表达的强度不尽相同，其转移能力受GJIC功能强弱的影响。

乳腺癌是妇女发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，远处转移是乳腺癌患者死亡的主要原因。Cx43是人类乳腺组织中主要表达的连接蛋白之一，Cx43的异常表达，在乳腺癌的发生、发展和转移方面均发挥重要作用。在肿瘤转移方面所发挥的作用目前有不同的研究结果，多项研究认为Cx43与乳腺癌的发生和转移有密切相关性，其表达与肿瘤分化程度呈正相关，而与肿瘤恶性进程和转移呈负相关［7，8］。本组在有转移和无转移的乳腺癌癌组织中检测Cx43蛋白，得出的结果与上述研究结果一致，即Cx43的表达与肿瘤转移呈负相关 。Cx43与肿瘤转移密切相关，分析其可能的机制是Cx43表达异常导致间隙连接(GJ)或GJIC异常，肿瘤细胞间的结合力下降，并能逃避正常生长控制及免疫监视，从而易于生长扩散和转移。也有认为Cx43在乳腺癌组织中表达下调可能与启动子甲基化有关。本组研究结果提示，肿瘤生长的不同时期其转移潜能不一样，肿瘤晚期转移潜能的增强，受GJIC功能逐渐减弱的影响。

综上所述，Cx43的表达与肿瘤转移呈负相关。但是，CX43在肿瘤转移方面所发挥的作用也有不同的研究结果，国内明佳等［9］探讨微小RNA－206(miR－206)和连接蛋白(Cx)43在乳腺癌原发灶(PTs)及腋窝转移淋巴结(MLNs)中的表达变化关系，结果发现与PTs相比较，MLNs中miR－206的mRNA表达较 PTs低(P＜0.05)，而 Cx43蛋白的表达较 PTs明显增加(P＜0.05)，在 PTs和MLNs中Cx43mRNA的表达没有统计学意义。我们认为在乳腺癌腋窝淋巴结转移过程中，Cx43与微小RNA基因的相互作用可能与乳腺癌腋窝淋巴结转移有关。肿瘤发生转移是多个因素、多步骤的复杂过程，Cx43基因与肿瘤发生和进展的相关性，除了蛋白水平的异常表达外，可能还有Cx基因突变，CxmRNA表达降低或异常表达等多方面的分子机制［10］，这些均有待于进一步深入研究。

［1］Lu C D，Altieri D C，Tanigawa N.Expression of a novel antiapoptosis gene，survivin，correlated with tumor cell apoptosis and p53 accumulation in gastric carcinomas［J］.Cancer Res，1998，58(9):1808 －1812.

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［7］Li Z，Zhou Z，Donahue H J.Alterations in Cx43 and OB －cadher in affect breast cancer cell metastatic potential.［J］.Clin Exp Metastasis，2008，25(3):265 －272.

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［10］梁智勇，史景泉.缝隙连接细胞间通讯与肿瘤的关系［J］.临床与实验病理学杂志，2001，17(5):432 －434.