杜仲皮和叶中黄酮的含量与抗氧化活性比较＊

王文君，向灿辉，霍 靖，罗建飞，孙志勇

(遵义医学院珠海校区，广东 珠海 519041)

杜仲皮具有补肝肾，强筋骨，调血压，防衰老，抗肿瘤等功效，对高血压具有独特疗效，被认为是最理想的天然降压药物之一［1－4］。近年来研究表明杜仲叶与皮有相似的化学成分和药理作用［5－7］，可以代皮供药用，另外有资料提及，杜仲叶中还含有多种杜仲皮中所没有的成分，具有新的开发利用价值，而且杜仲属于落叶乔木，其叶子是可再生的，资源丰富。因此，杜仲皮和杜仲叶综合开发利用，将有利于扩大药源及药材的充分利用。我们拟对杜仲皮和杜仲叶中的黄酮进行含量测定及抗氧化性比较分析，为杜仲黄酮的综合开发提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料 杜仲皮提取物、杜仲叶提取物(自制)，芦丁标准品(成都曼思特生物科技有限公司)，ABTS标准品(美国Sigma公司)，其他试剂均为国产分析纯。

BSA124S电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，UV－2550型紫外分光光度计(日本岛津)，Scientz－10W冷冻干燥机(宁新生物科技有限公司)，旋转蒸发仪(上海夏丰实业有限公司)，抽滤器(巩义市予华仪器有限责任公司)。

1.2 方法与步骤

1.2.1 杜仲皮、叶粗提物制备［8］杜仲皮、叶，粉碎，过80目筛，石油醚脱脂，然后用体积分数50%的乙醇溶液以1∶3料液比超声浸提30 min，抽滤，浓缩。

1.2.2 粗提物纯化 用聚酰胺柱层析法，湿法上样，以体积分数为15%，30%，55%的乙醇溶液进行洗脱，浓缩、冻干，得到固体样品，杜仲皮的样品为 S1、S2和 S3，杜仲叶的样品为 S4、S5和 S6。

1.2.3 TLC 色谱定性分析

1.2.3.1 微乳液展开剂色谱法 用十二烷基硫酸钠:正丁醇:正庚烷按照 3.9∶5.2∶0.91(质量比)称取各试剂，加入适量水，使水的含量达到70%，配制总量为100g，即为微乳液展开剂。用毛细管在聚酰胺薄膜上点样，展开。

1.2.3.2 正丁醇:冰醋酸:水展开剂色谱分析 用正丁醇:冰醋酸:水以4∶1∶2混合作为展开剂，用毛细管在聚酰胺薄膜上点样，展开。

1.2.4 杜仲总黄酮含量测定 精密称取芦丁标准对照品5.0 mg，置于25.00 mL的容量瓶中，加乙醇适量，置于水浴锅上微热使芦丁溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀，移取对照品 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分别置于25.00 mL 容量瓶中，各加乙醇10 mL，加5%NaNO2溶液 1.00 mL，摇匀放置8 min，再加10%Al(NO3)3溶液 1.00 mL，摇匀，再放置6 min，加4%NaOH溶液8.00 mL，定容。摇匀放置10～20 min，，以试剂空白作参比，在497 nm处测定吸光度。样品也在同样条件下进行3次平行试验测定吸光度。

1.2.5 抗氧化性分析 精密称取Vc、芦丁标准品以及各样品适量，配制成一系列不同浓度的乙醇溶液，分别取各溶液30 μl加入3 mL ABTS+工作液，以无水乙醇代替样品加入ABTS+工作液为空白。充分摇匀，静置3 min后，于734 nm下测其吸光度A。

2 结果

2.1 TLC薄层色谱分析结果

2.1.1 微乳液展开剂色谱鉴定结果 以槲皮素、芦丁为对照品，展开杜仲叶、杜仲皮提取物，在365nm紫外灯下观察，芦丁的比移值为0.43，而样品在此处均无斑点，表明皮和叶中都不含有芦丁。而槲皮素几乎没有展开，仍在原点，两个样品在原点也均有斑点，所以样品中可能都含有槲皮素。此外，叶的样品在比移值0.14、0.29处出现两个斑点表现为红色荧光，皮的样品在0.61、0.79处有两个斑点。但由于没有对照品，无法确定物质成分。

2.1.2 正丁醇:冰醋酸:水混合展开剂色谱鉴定结果 以槲皮素为对照品，槲皮素的比移值为0.21，皮和叶的样品在比移值0.21处也有斑点，表明两样品中均含有槲皮素。

2.2 定量分析

2.2.1 绘制芦丁标准曲线 标准曲线的回归方程为 A=10.525c －0.0414，R2=0.9996，其中 A 为吸光度，c为浓度(mg/mL)。R为线性相关系数。从相关系数可以确定线性很好，可用于定量分析，线性范围0.016 ～0.080mg/mL。

2.2.2 样品总黄酮含量测定

表1 样品含量测定数据

每个样品重复测定了3次，精密度比较好。从结果可以看出，对于杜仲皮和叶的纯化产物，15%、55%的乙醇提取物黄酮含量彼此接近，而对于30%的乙醇提取物，杜仲叶的黄酮含量要高于对应的杜仲皮的黄酮含量。由此也可以看出，杜仲叶中同样富含黄酮，可以作为提取黄酮的原料。同时，聚酰胺对杜仲黄酮具有一定的纯化能力，但效率有限，最好纯度达到41.50%，需进一步研究纯化条件。

2.3.1 芦丁对照品抗氧化测定结果

图1 芦丁标准品清除ABTS+曲线

2.3.2 Vc对照品抗氧化测定结果

图2 Vc清除ABTS+曲线

2.3.3 S1的抗氧化测定结果

图3 S1的ABTS+清除曲线

2.3.4 S2的 ABTS+测定结果

图4 S2的 ABTS+清除曲线

2.3.5 S3的 ABTS+测定结果

图5 S3ABTS+清除曲线

2.3.6 S4样品抗氧化性测定结果

图6 S4样品清除ABTS+·曲线

2.3.7 S5样品抗氧化性测定结果

图7 S5样品清除ABTS+·曲线

2.3.8 S6样品抗氧化性测定结果

图8 S6样品清除ABTS+·曲线

从清除率曲线可以看出，所有样品对自由基的清除能力均随着抗氧化剂浓度的增大而增强，并且抗氧化能力随浓度变化表现出较好的线性关系。即，所有的样品均具有一定的抗氧化活性。为了较好的比较杜仲皮和叶中黄酮的抗氧化能力，我们同时分析了所有样品的半抑制率(EC50)，EC50值越小，表明该物质的抗氧化能力越强，测定结果(见表2)。

表2 样品的EC50数据

结果表明:采用同样的提取方法、同样的纯化条件，得到的对应样品的抗氧化活性数据很接近，15%的乙醇洗脱产物，皮中黄酮的EC50值为1.948 mg/mL，而叶中黄酮的 EC50值为1.819 mg/mL;30%的乙醇洗脱产物，皮中黄酮的EC50值为2.379 mg/mL，而叶中黄酮的 EC50值为 2.368 mg/mL，两数据非常接近;55%的乙醇洗脱产物，皮中黄酮的EC50值为 3.133 mg/mL，而叶中黄酮的 EC50值为3.312mg/mL。这就说明杜仲皮和叶中的黄酮的抗氧化能力很接近，可以以叶代皮使用。但从EC50值也可得出，杜仲皮、叶黄酮的抗氧化活性均弱于Vc和芦丁对照品。

3 讨论

把杜仲叶和皮的粗提物经过聚酰胺柱层析的相同洗脱段的黄酮含量和抗氧化活性进行组间比较发现，15%、30%的乙醇洗脱产物所得黄酮含量两两样间分别存在显著性差异，显著性水平分别为0.042和0.002，均＜0.05，具有统计学意义。55%的乙醇溶剂洗脱产物所得黄酮含量两样间不存在显著性差异，显著性水平为0.17;15%、30%和55%的乙醇洗脱产物所得黄酮的抗氧化能力两两样间均不存在显著性差异，显著性水平分别为0.19、0.90和0.082。从统计学数据可以说明杜仲叶中黄酮和皮中的黄酮含量接近，也有不同，但抗氧化活性是相同的，所以开发叶中的黄酮是有价值的。研究结果也表明聚酰胺对杜仲黄酮具有一定的富集纯化能力，但效果有限，纯化条件要进一步探索。

综上所述，杜仲叶中含有黄酮，并且和杜仲皮中黄酮的抗氧化活性接近，可以叶代皮使用，扩大药源。杜仲皮和叶中均不含有芦丁，均含有槲皮素。

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