乙型肝炎肝硬化患者外周血单个核细胞Toll样受体4的变化*

阎双缓 陈翠英 王素平 唐亚芳 宋海燕 耿建章 王晓静 高朋彬

Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是连接天然免疫及获得性免疫系统的重要桥梁[1、2]，其中TLR4主要表达在巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞及内皮细胞上，它识别病原体相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）而引起机体特异性免疫反应。TLR4在乙型肝炎中的作用机制复杂，其特异的模式识别方式和相互调节的网络反应参与了慢性HBV感染的发病，同时具有抗HBV复制的作用[3、4]。但TLR4在慢性HBV感染的发生、慢性化、重型化，以及肝癌的发生中的确切作用和具体机制尚不清楚。本研究观察了乙型肝炎肝硬化患者外周血单个核细胞表面TLR4受体表达水平。

资料与方法

一、研究对象 收集2010年2月至2011年2月我院门诊及住院的慢性HBV感染者70例，其中慢性HBV携带者30例（男性19例，女性11例，平均年龄40±10岁），乙型肝炎肝硬化患者40例（男性30例，女性10例，平均年龄52±8岁，Child-Pugh A级15例，B级13例，C级12例）。符合2000年西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》的诊断标准[5]。另选健康对照人群30例，男性18例，女性12例，平均年龄31±11岁。排除HAV、HCV、HDV、HEV 或HIV合并感染及肝癌患者，近3个月内未用过抗病毒药物及糖皮质激素等影响免疫功能的药物。

二、外周血单个核细胞TLR4检测 使用流式细胞仪检测，取EDTA抗凝血细胞悬液100μl，分别加入APC-抗-CD14单克隆抗体 10μl和 PE-抗 -TLR4单克隆抗体10μl，室温放置30min，加入红细胞裂解液2ml，避光静置15min，离心，加1ml PBS震荡洗涤2次，设置不加抗体阴性对照。离心弃去保存液，所得细胞以PBS调整细胞数至2×109/L，将标本置于流式细胞仪上，以APC-抗-CD14阳性设门，共获取门内10000个单个核细胞。经Cellquest统计软件分析，获取直方图，以平均免疫荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）表示 TLR4 的表达强度。

三、血清白细胞介素6（IL-6）水平检测 采用ELISA法。无菌采集静脉血5ml，常规离心后取血清，-80℃冰箱保存，待测。ELISA试剂盒为晶美生物有限公司分装的美国Genzyme公司产品。

结果

一、外周血单个核细胞TLR4表达和血清IL-6水平 乙型肝炎肝硬化患者外周血单个核细胞TLR4表达和血清IL-6水平比正常对照人群明显升高（P＜0.01）；慢性HBV携带者与正常人外周血单个核细胞TLR4水平无明显差异（P＞0.05）；慢性HBV携带者血清IL-6水平高于正常人（P＜0.01，表1）。乙型肝炎肝硬化患者外周血单个核细胞TLR4水平与血清IL-6水平呈显著性正相关（γ＝0.768，P=0.0078），而HBV携带者外周血单个核细胞TLR4表达与血清IL-6水平无显著性相关（γq＝-0.775，P＝0.375）。

表1 各组人群外周血单个核细胞TLR4表达和血清IL-6水平（）

表1 各组人群外周血单个核细胞TLR4表达和血清IL-6水平（）

与正常组比，①P＜0.01

组别 例数 TLR4（MFI） IL-6（ng/L）正常人 30 3.2±2.1 15.6±5.6 HBV 携带者 30 3.8±1.8 45.6±36.8①肝硬化 40 13.5±4.6① 80.5±36.5①

二、肝功能不同分级乙型肝炎肝硬化患者外周血单个核细胞TLR4表达与血清IL-6水平比较 从Child A级、Child B级到Child C级，患者外周血单个核细胞TLR4表达与血清IL-6水平依次升高，有统计学意义，见表2。

表2 肝硬化患者外周血单个核细胞TLR4和血清IL-6水平（）

表2 肝硬化患者外周血单个核细胞TLR4和血清IL-6水平（）

与 Child A 组比，①P＜0.05，②P＜0.01；与 Child B 组比，③P＜0.05，④P＜0.01

例数 TLR4（MFI） IL-6（ng/L）Child A 15 7.9±5.5 29.68±17.85 Child B 13 11.8±4.8① 57.37±28.55②Child C 12 16.5±7.6①③ 95.98±30.58②④

讨论

TLR4的识别谱广，生物学作用广泛，主要包括调控获得性免疫反应和引发炎症反应等。TLR4表达于细胞表面，能直接识别病毒蛋白颗粒，不但具有促进细胞因子的合成与释放、促进免疫细胞成熟、分化和功能发挥等作用，还在调节机体对入侵病原体的免疫应答水平及抗病毒方面有不容忽视的作用[6]。Mozer-Lisewska等[7]在HBV感染儿童患者肝组织发现TLR4的表达，而正常肝组织则无表达。也有报道TLR4在慢性乙型肝炎肝组织存在高表达，提示TLR4在乙型肝炎发病中的作用是一个值得探讨的问题。

我们的研究结果表明，在乙型肝炎肝硬化患者存在外周血单个核细胞TLR4的过度表达，且外周血单个核细胞TLR4表达水平与血清IL-6水平存在密切关系。目前，关于TLR4表达的调控机制研究还比较少。Manigol等[8]认为肝硬化患者内毒素可致TLR4表达变化，内毒素是TLR4最重要的配体，体内内毒素等刺激信号以及高水平IL-6可导致外周血单个核细胞TLR4表达增高[9]。慢性肝炎患者由于肠道菌群紊乱和细菌过度生长以及胃肠道黏膜淤血，使肠道产生、吸收内毒素增加，同时由于肝细胞大量坏死，免疫功能下降，枯否细胞清除能力下降，因而对内毒素及内毒素免疫复合物的清除减少，导致内毒素血症[10]。内毒素、凋亡细胞等TLR4刺激信号，有可能导致外周血单个核细胞对上述刺激信号产生过度反应[11]。IL-6可以通过多种信号通路导致肝细胞的凋亡和坏死，血清IL-6水平与慢性肝病病情进展有关，与肝脏病变程度也相关[12，13]。

乙型肝炎肝硬化患者外周血单个核细胞TLR4表达与血清IL-6水平随着Child分级的逐渐升高而相应增加，表明TLR4表达及IL-6水平随着肝功能受损程度的加重而增加，它可能参与了乙型肝炎肝硬化的发病及病理发展过程。乙型肝炎肝硬化患者外周血单个核细胞TLR4表达水平与血清IL-6水平呈现显著正相关，IL-6可能上调单个核细胞TLR4的表达，而单个核细胞TLR4的表达上调又有可能导致单个核细胞IL-6的表达增加，两者之间可以相互影响，从而在乙型肝炎肝硬化的发病过程中共同发挥一定的作用。

研究亦发现，慢性HBV携带者与正常人外周血单个核细胞TLR4水平无明显差异，HBV携带者血清IL-6水平高于正常人。田华[14]的研究结果表明，慢性HBV携带者血清IL-6水平高于正常人，慢性乙型肝炎患者血清IL-6水平高于HBV携带者，表明血清IL-6水平与病毒复制有关，更与肝细胞受损的程度有关。慢性HBV携带者外周血单个核细胞TLR4表达与血清IL-6水平无显著相关，血清IL-6水平升高，但不足以诱发大量TLR4产生，故TLR4介导的肝损伤不明显，这也可能是此类患者肝功能保持相对稳定的原因。

可见，外周血单个核细胞TLR4表达水平与肝硬化的发病及进展有关。监测TLR4的动态变化有助于指导治疗。在抗病毒治疗基础上，通过提高免疫、调节肠道微生态环境等措施，减少肠源性内毒素的产生和吸收，减少TLR4信号转导造成的免疫损伤，有可能延缓或减少肝硬化失代偿和原发性肝癌的发生。

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