水稻胚乳双向电泳技术体系的优化分析

2012-09-20赵书宇刘海英金正勋张忠臣张海彬王露露

东北农业大学学报 2012年4期

赵书宇，刘海英，沈鹏，金正勋，张忠臣，张海彬，王露露

（东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

胚乳是水稻的主要食用部位，胚乳的形成和发育直接影响着水稻的产量和品质[1]。胚乳的主要成分是淀粉和蛋白质，因此，籽粒灌浆过程也是淀粉和蛋白质的合成与积累过程，在此过程中众多的酶参与其中。有效地分离和鉴定灌浆过程中胚乳的蛋白质对深入了解稻米品质形成的生化学机理具有十分重要的意义。近年来，迅速发展的蛋白质组学能使我们更深刻地了解蛋白质的功能及其相互调控机制，而且在逆境生理、杂种优势、品质研究中的应用也较广泛[2]。单彩云对470份国内外大豆资源进行室内分级筛选，并对耐低温资源绥农14的子叶和真叶进行低温处理，利用2D技术寻找耐低温相关蛋白。在绥农14子叶处理试验中，处理与对照表达量相差3.5倍以上的蛋白质点共获得29个，其中4℃处理上调表达有13个点，下调表达蛋白质点16个[3]。白月等用双向电泳技术分析水稻少侧根突变系MT10及其野生型IR8的根系全蛋白质组，建立二者间的差异表达图谱，得到了11个差异点，其中只在MT10中表达的蛋白点有2个，只在IR8中表达的蛋白点有4个，两者间有明显差异的蛋白点有5个[4]。刘文文等应用双向电泳（2-DE）技术分析了烯丙异噻唑诱导后水稻蛋白质的差异表达，在诱导4 d的双向电泳图谱上找到了10个差异表达蛋白质点，选取其中3个进行质谱（MALDI-TOF-MS）分析，分别具有泛醌-细胞色素C还原酶、苏氨酸肽链内切酶和苹果酸脱氢酶活性[5]。

双向电泳技术是蛋白质组学的核心技术，它包括蛋白质的提取、纯化、等电聚焦和SDS-PAGE电泳、凝胶染色、图像分析等技术[6]。其中蛋白质提取和上样量大小、胶条转移等对蛋白质分离效果影响很大。郝强等以北海道黄杨为模型植物，比较了TCA/丙酮法、酚法和酚/SDS法三种蛋白质提取方法，结果表明三种提取方法使得电泳结果相差很大，而改进的酚/SDS法所得结果最好[7]。

本试验选用水稻抽穗后10 d的籽粒，采用不同的蛋白质提取方法和上样量、胶条转移等对胚乳蛋白质进行分离效果比较分析，旨在建立适用于水稻胚乳蛋白质的双向电泳技术体系，为分离鉴定水稻胚乳蛋白质提供技术平台。

1 材料与方法

1.1 材料

选用东农08-18稳定品系的直链淀粉含量不同的两个材料进行盆栽试验。盆规格为直径25 cm，高度30 cm，每盆4棵生长一致的秧苗，穴间距一致，每个材料重复3次，按常规方法进行肥水管理。抽穗时选取同一天抽穗挂牌标记，抽穗后10 d取挂牌标记的5个穗，取穗中上部灌浆一致的籽粒，剥去颖壳置于冻存管中-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 水稻胚乳蛋白的提取

1.2.1.1 TCA-丙酮法

取冻存籽粒20粒，用灭菌预冷的剪刀和镊子在预冷的研钵中迅速剥去种皮，切去胚，加0.2%PVP迅速研磨至糊状，悬浮于含0.07%DTT的预冷10%TCA-丙酮，-20℃过夜。次日4℃35 000 r·min-1离心15 min，弃上清，将沉淀重悬于80%丙酮，于-20 ℃温浴l h，4 ℃ 16 000 r·min-1离心15 min。沉淀重悬于100%丙酮，于-20℃温浴l h，4℃16 000 r·min-1离心15 min。重复此步骤2～4次，倒出上清液，离心管置于冰浴中抽真空15 min至丙酮完全挥发，得到的蛋白为粗蛋白。

1.2.1.2 酚法

参照易克等方法[8]，取冻存籽粒20粒，加5倍体积提取缓冲液及0.5%PVP。12 000 r·min-1离心10 min，取上清液。加入等体积的水饱和酚（pH 8.0），充分振荡，静置10 min后，12 000 r·min-1离心5 min。取酚相液体，加入5倍体积0.1 mol·L-1乙醇铵，置于-20℃下30 min，充分洗涤沉淀4次以上，除尽乙醇铵，冷冻抽干，所得干粉为粗蛋白。

1.2.2 蛋白裂解及含量测定

用离心管称取30 mg粗蛋白干粉，向干粉中加入 500 μL 裂解缓冲液（8 mol·L-1urea，2 mol·L-1thiourea，4%CHAPS，2.5%pH 4～7 IPG buffer，1%DTT），36℃温浴1 h，离心时间取上清，其余两份作为该样品的重复。采用Bradford法进行蛋白定量[5]，以蛋白质裂解液为空白，1 mg·mL-1的牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BAS）标准蛋白（标准蛋白溶液用蛋白质裂解液配制）为标准，在紫外-可见分光光度计下测定595 nm的吸光值，绘制标准曲线，用于计算蛋白质样品的含量。

1.2.3 双向电泳

1.2.3.1 样品被动上样及等电聚焦

选用17 cm IPG胶条（pH 4～7）。IPG干胶条胶面朝下放入水化液的水代盘中，覆盖一层矿物油以防止等电聚焦时尿素析出，蛋白氧化及产生冷凝水，被动水化14 h后，置于Bio-Rad等电聚焦仪中，等电聚焦在20℃条件下自动进行，每胶条限流50 μA。等电聚焦参数如下：

①500 V 4 h 除盐；

②1 000 V 1 h 线性上升（Gra）；

③8 000 V 2.5 h 线性上升（Gra）；

④8 000 V 0.5 h聚焦。

1.2.3.2 胶条的平衡

将等电聚胶后的胶条胶面向上置于5 mL平衡缓冲液Ⅰ（50 mmol·L-1Tris-HCL，pH 8.8，6 mol·L-1urea，30%甘油，2%SDS，0.002%溴酚蓝，1%DTT）中平衡摇床震荡15 min，然后再置于5 mL平衡缓冲液Ⅱ（50 mmol·L-1Tris-HCL，pH 8.8，6 mol·L-1urea，30%甘油，2%SDS，0.002%溴酚蓝，2.5%碘乙酰胺）中平衡15 min，取出后放在湿润的定性滤纸上，以吸去表面多余的液体。

1.2.3.3 SDS-PAGE

采用Bio-Rad垂直电泳系统，胶的浓度为12%，将平衡后的胶条放置于已聚合的聚丙烯酰胺凝胶胶面上，用0.5%的低熔点琼脂糖封顶液封闭排除气泡。在电泳槽中加入约1.5 L电泳缓冲液（0.025 mol·L-1Tris， 0.192 mol·L-1Glyeine， 0.1%SDS）第一步每块胶10 mA下电泳30 min，第二步每块胶20 mA下电泳至溴酚蓝前沿距离玻璃板下缘0.5 cm时停止电泳。

1.2.3.4 考马斯亮蓝染色

电泳后将凝胶立即放入固定液（40%甲醇，l0%乙酸）中至少30 min，可过夜；充分固定后用Millipore纯净水洗2次，每次5 min；换置考马斯亮蓝染液（10%硫酸铵，10%磷酸，20%甲醇，0.06%考马斯亮蓝G250染色，至少2 h；用脱色液（25%乙醇，8%乙酸）脱去底色，或者直接用Millipore纯净水脱色，直到蛋白点清晰为止。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法对胚乳蛋白分离效果的影响

蛋白质样品制备是双向凝胶电泳最为关键的步骤之一。样品制备中关键为有效的去除淀粉等干扰成分，尽可能扩大其溶解度和解聚，尽量减少蛋白提取过程中的降解和丢失，以提高分辨率。图1A、B分别为利用TCA-丙酮法和酚法提取蛋白质的电泳结果。通过比较图1A和B可以看出，不同的蛋白质提取方法对双向电泳的分离效果有较大影响。使用PD Quest分析软件对图1A、B进行分析，图1A共检测到蛋白点数（321±5）个，图1B共检测到蛋白点数（195±5）个，而且TCA-丙酮提取法的双向电泳结果清晰度明显好于酚法结果，酚法样品在等电聚焦过程中电压未能达到8 000 V，这可能是由于酚法提取的蛋白样品会混有比较多的盐离子，影响了聚焦效果。

2.2 不同上样量对胚乳蛋白分离效果的影响

上样量大小对电泳结果的清晰程度有很大的影响。上样量太小，低丰度蛋白就无法被识别；相反，如果上样量过大，虽然可以看到低丰度蛋白，但是会导致一些蛋白点过大而多点重合，为分析造成困难。图2中A、B、C分别是100、300、500 μg三种上样量的电泳结果。通过比较可以看出，100 μg上样量的电泳图上共检测到蛋白点数为（102±5）个，几乎看不到低丰度蛋白，而且其背景要深于图2B和C；而500 μg上样量的电泳图上共检测到蛋白点数（310±5）个，有明显的横纹且横向分离效果不好，放大区域可以看到有些点重合在一起。而300 μg上样量的电泳图上共检测到蛋白点数（331±5）个，蛋白点数与500 μg上样量结果相差不多，但是图像清晰没有横纹和过大的蛋白点，便于分析。

图1 不同蛋白提取方法的双向电泳结果Fig.1 Two-dimensional gel electrophoresis result of sample in different extraction method

2.3 胶条的转移与封闭对胚乳蛋白分离效果的影响

等电聚焦完成后，将IEF胶条转移到第二向SDS-PAGE这一过程同样是双向电泳的关键过程之一，主要涉及IEF胶的固定和平衡以及包埋[9]。在这个过程中最容易出现胶条不平整和蛋白质扩散的问题，从而影响电泳的分辨率和准确度，应该加以精细的操作和调控。如图3所示，左边图中为包埋不平整的电泳图片，可以明显看出图中标出区域中的蛋白点相对右边包埋较好的图片中同一区域的蛋白点位置发生了偏移，而且向中间聚集。影响了电泳图片的比对和分析。这可能是由于在加入封顶液时产生了较大的气泡造成的。

图2 不同上样量的样品双向电泳结果Fig.2 Two-dimensional gel electrophoresis results of different samples loaded quantity

图3 不同包埋效果的双向电泳结果比较Fig.3 Comparison of two-dimensional gel electrophoresis by different embedding dispose

3 讨论与结论

3.1 水稻胚乳蛋白的提取

蛋白样品的提取和制备是进行蛋白质组学分析的关键步骤，蛋白样品的纯度和再溶性直接影响双向电泳（2-DE）分离结果的清晰度和重复性[10]。一般的蛋白质样品制备过程常采用丙酮、三氯乙酸或硫酸铵进行沉淀[11]。本试验比较了TCA-丙酮法和酚法提取水稻胚乳蛋白的双向电泳结果，发现利用TCA-丙酮提取蛋白，不仅提取效率高，而且杂质干扰少，得到的电泳结果，蛋白条带清晰，数量较多。酚法虽然所得到的蛋白再溶性要好于TCA-丙酮法，但是样品中混杂的盐离子等小分子杂质较多，使得等电聚焦不容易上升到设定的最高电压。当然这种影响可以通过多次溶解来去除，但是这样会损失一些低丰度蛋白，也有违提取操作尽量简单的原则。因此，综合考虑应该选择TCA-丙酮法。

TCA-丙酮法所得的粗蛋白很多，但是再溶解性较差。在对粗蛋白用裂解液溶解的时候，可以用多个离心管同时溶解，离心取上清时合并同一样品，这样可以加大溶解效率，减小蛋白样品中不溶物的干扰。

提取的整个过程要在低温条件下进行，以防止蛋白被蛋白酶降解。由于要提取的是水稻籽粒的胚乳蛋白，为避免引入种皮和胚中蛋白的干扰，就要把种皮和胚完全去掉，这个过程要尽可能快速且在预冷的研钵中完成，所用的镊子和剪刀要灭菌预冷。由于操作精细，可以事先多加练习以加快操作速度。

3.2 上样量的选择

上样量的选择是一个比较精细的工作，有的时候仅仅相差几十微克的上样量，所得到的电泳结果却相差很大。因此，需要在参考前人实验结果的同时，还应该对上样量进行多次试验和摸索，对结果进行多次比较，从而确定最佳上样量[12]。本试验比较了100、300、500 μg三种不同上样量的双向电泳的结果，发现在上样量为300 μg时，得到最多的蛋白点数和背景清晰的电泳图。这是由于，在电泳槽中加入含有100 μg胚乳蛋白的水化液时，由于蛋白质含量较少，很多低丰度的蛋白虽然存在，却不能被分离出来。这样所得的图像就如图2A所示，只有一些高丰度蛋白能被看到，而且背景相对要深一些。如果上样量达到过高，反而蛋白点要少，这是因为聚焦过程中蛋白质浓度过高而在胶槽中沉淀，不能很好地进入IPG胶条中造成的[13]。

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