皖南地区汉族人群21号染色体上3个STR位点的多态性分析

何淑凤，李 慧，李铁臣，孙 青

(1.皖南医学院附属弋矶山医院 妇产科，安徽 芜湖 241001;2.皖南医学院 分子生物学研究室，安徽 芜湖 241002)

唐氏综合征(Down syndrome，DS)，也称21三体综合征，是最常见的染色体数目异常性疾病，活婴的发病率为1/1 000～1/800［1］，发病机制是由于21号染色体全部或者部分三体所导致的［2］，目前尚无理想的治疗方法，主要通过产前筛查和诊断，终止妊娠而降低患儿出生率。传统的细胞遗传学分析技术是确诊21三体的金标准，但孕早期行羊水、绒毛膜穿刺可能会导致流产［3］，稍许污染可能导致细胞培养失败［4］以及耗时长等缺点限制了其在临床快速产前诊断中的广泛应用。Bili等［5］研究认为短串联重复序列(short tandem repeat，STR)是定量检测染色体数目异常最合适的遗传标记之一。因此本实验通过毛细血管电泳对STR分型的方法，研究21号染色体上的3个位点的多态性，从而探讨一种更为快速、准确的对DS患者进行STR分型的方法。

1 对象与方法

1.1 DNA标本 100例正常人EDTA抗凝血均来自皖南医学院附属弋矶山医院体检中心2009年2～4月，经体检指标均正常且无血缘关系的汉族个体，其中男性74例，女性26例，年龄16～63岁，平均为(37.82±10.08)岁，常规酚-氯仿抽提DNA，于4℃冰箱保存备用。

1.2 PCR扩增 D21S55(21q22.2)及21q22.3远端被称为DS关键区(down syndrome critical region，DSCR)。选取21号染色体核心区域及其附近的3个STR位点(D21S11、D21S1409和 D21S1414)，根据3个STR位点分别设计引物，上游引物5'端分别用FAM荧光标记，引物序列来源于NCBI的UniSTS数据库(http://www.ncbi.n1m.nih.gov/unists/)，由上海捷瑞生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

反应体系 PCR总反应体积50μl:其中10×Buffer(含 Mg2+)5 μl，dNTP Mixture(10 mM/μl)1 μl，上下游引物各 0.5 μl，模板 DNA 2 μl，Taq 酶(Tiangen公司，2.5 U/μl)1 μl，加双蒸水至总体积50 μl。

仪器:Mycycler型热循环仪(Bio-Rad公司)。循环条件:98℃预变性5 min，加入Taq酶，进入热循环，94℃变性30 s。复性45 s(D21S11、D21S1409及D21S1414的退火温度分别为:58℃、60℃及64℃)，72℃延伸30 s，共35个循环。最后72℃延伸4 min，产物4℃冰箱保存。

PCR产物10μl加样，1%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，证实有目标带后，拍照，产物-20℃避光保存。每管PCR产物，分成两份，一份行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，250 V预电泳30 min，4 μl PCR产物混合6μl上样缓冲液，加样，电泳3～4 h，银染，X光读片灯下观察结果，拍照保存;另一份送北京诺赛基因组研究中心经ABI Prism3730遗传分析仪进行STR位点扫描和分型。

1.3 数据处理 统计观察杂合度，统计学处理采用SPSS13.0软件包进行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

二倍体个体中，单个STR基因座经PCR扩增和电泳图谱分析表现为纯合子个体只有一条带或一个基因峰而杂合子有两条带或两个基因峰。D21S11、D21S1409和D21S1414位点产物片段大小分别在223～225 bp、181～197 bp和346～350 bp之间。聚丙烯酰胺凝胶电泳分型结果见图1～3;毛细血管电泳STR分型结果见图4～6。

2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2 STR基因型图谱

图1 D21S11位点PCR产物6%聚丙烯酰胺电泳结果D21S11 位点 M:200 bp;泳道1、2、3、5、6、7、8 为杂合子;4 空;9、10、11、12 为纯合子Fig 1 M:200 bp;Lanes 1，2，3，5，6，7 and 8 showing the heterozygote;4:Empty;9，10，11 and 12 indicating the homozygote

图2 D21S1409位点PCR产物6%聚丙烯酰胺电泳结果D21S1409 位点 M:100 bp;泳道1、2、4、9、12 为纯合子;3、5、6、8、10、11为杂合子;7空Fig 2 M:100 bp;Lanes 1，2，4，9 and 12 representing the homozygote;3，5，6，8，10 and 11，the heterozygote;7:Empty

图3 D21S1414位点PCR产物6%聚丙烯酰胺电泳结果D21S1414 位点 M:从下至上:300 bp，400 bp;泳道1、2、3、4、5、6、11、12、13 为杂合子;7、8、9、10 为纯合子Fig 3 M:From bottom to up:300 bp，400 bp;Lanes 1，2，3，4，5，6，11，12 and 13 indicating the heterozygote，and 7，8.9 and 10，the homozygote

图4 D21S11位点分型结果正常二倍体为杂合子时表现1∶1两条带图谱(图4a);为纯合子表现为一条带图谱(图4b)Fig 4 The STR result at locus D21S11Two stripes appeared in the normal heterozygote diplont sample with a dosage ratio of 1∶1(Fig 4a)，and one stripe was seen in the homozygote(Fig 4b)

图5 D21S1409位点分型结果正常二倍体为杂合子时表现1∶1两条带图谱(图5a);为纯合子表现为一条带图谱(图5b)Fig 5 The STR result at locus D21S1409Two stripes were seen in the normal heterozygote diplont sample with a dosage ratio of 1∶1(Fig 5a)and one in the homozygote(Fig 5b)

图6 D21S1414位点分型结果正常二倍体为杂合子时表现1∶1两条带图谱(图6a);为纯合子表现为一条带图谱(图6b)Fig 6 The STR result at locus D21S1414Two stripes were observed in the normal heterozygote diplont sample with a dosage ratio of 1∶1(Fig 6a)，and one in the homozygote(Fig 6b)

2.3 观察杂合度 100例标本中，用毛细血管电泳技术进行STR位点分型所检测出D21S11位点杂合子76例，纯合子 24例，观察杂合度为 0.76;D21S1409位点杂合子66例，纯合子34例，观察杂合度为0.66;D21S1414位点杂合子78例，纯合子22例，观察杂合度为0.78。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测出D21S11位点杂合子77例，纯合子23例，观察杂合度为0.77;D21S1409位点杂合子65例，纯合子35例，观察杂合度为0.65;D21S1414位点杂合子73例，纯合子27例，观察杂合度为0.73。观察杂合度见表2。

3 讨论

有研究证实，STR在不同种族、人群之间的杂合度(observed heterozygosity，Ht)和等位基因频率分布有一定的差异，因此可以作为一种遗传标记(genetic marker，GM)应用于人类群体遗传学及法医学的研究［6］。对于STR位点遗传多态性的评价标准，国内外学者有不同的判断标准，Gill等［7］认为当观察杂合度≥0.7的基因座才具有高鉴别力。国内作者陈雁［8］则选择杂合度超过0.62，判断此遗传标记具有高度多态性。因此，在不同民族和地区研究发现21号染色体上高杂合度的STR位点，是进行唐氏综合征快速产前诊断的基础。本实验结果统计D21S11、D21S1409及 D21S1414的杂合度为:0.7600(76/100)、0.6600(66/100)和 0.7800(78/100)，我们也认为STR位点杂合度≥0.7以上具有高度多态性。D21S11、D21S1414杂合度分别在0.7以上，可以作为安徽皖南地区唐氏综合征的筛查位点，D21S1409杂合度在0.66，可以作为唐氏综合征患者的辅助诊断位点。联合使用多个位点进行QF-PCR检测非整倍体包括X，Y，21，18，13染色体其敏感性和特异性达到 100%［4］。

本实验通过两种方法对D21S11、D21S1409位点所统计杂合度与本组研究人员［9］前期通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染方法所得杂合度不同，本实验D21S11位点杂合度0.7600(76/100)，此数据明显高于李慧［9］等统计的杂合度0.4778(43/90)，差异具有统计学意义(P＜0.05)，D21S1409位点杂合度0.6600(66/100)，与李慧［9］统计杂合度 0.6222(56/90)相差较小，差异无统计学意义(P＞0.05)。究其原因，对前期部分标本进行再次银染，结果发现原本认为是一条带标本经过再次银染后得到的结果为两条带，可能是由于前期银染过程中银染过度所引起，从而主观误认为是纯合子。进而表明，银染方法统计杂合度存在一定的主观判断，使得碱基相差较小的两个片段难以区别。表2为两种方法对100例相同标本所统计的观察杂合度，D21S11、D21S1409及D21S1414位点两种方法统计结果差异均无统计学意义(P＞0.05)，因此PCR与毛细血管电泳技术相结合有望实现基因分析系统的全自动化，无论对临床诊断还是基因工程中基因片段的分离分析研究均有重要意义。

表2 观察杂合度Tab 2 Observed Heterozygosity

毛细血管电泳进行STR分型技术虽然有其优越性，但对于嵌合型的21三体及纯合子的患者难以诊断［10］，需要结合可以对基因组定量的技术，如依赖探针连接的多重扩增技术(MLPA)，可以通过与正常人的比较测定DNA的相对量，从而对嵌合型作出诊断，需要进一步的研究［11］。

?

［1］ DUFFY KJ，LITTRELL J，LOCKE A，et al．A novel procedure for genotyping of single nucleotide polymorphisms in trisomy with genomic DNA and the invader assay［J］.Nucleic Acids Res，2008，36(22):e145.

［2］ RAMALHO C，BRANDÃO O，MATIASA，et al．Phenotypic Variability in Fetuses with Down Syndrome:A Case-Control Pathological Evaluation［J］.Fetal Diagn Ther，2011，30(3):207-214.

［3］ MADDOCKSDG，ALBERRY MS，ATTILAKOSG，et al．The SAFE project:towards non-invasive prenatal diagnosis［J］.Biochem Soc Trans，2009，37(Pt 2):460-465.

［4］ JAIN S，AGARWAL S，PANIGRAHI I，et al．Diagnosis of Down syndrome and detection of origin of nondisjunction by short tandem repeat analysis［J］.Genet Test Mol Biomarkers，2010，14(4):489-491.

［5］ BILI C，DIVANE A，APESSOSA，et al．Prenatal diagnosis of common aneuploidies using quantitative fluorescent PCR［J］.Prenat Diagn，2002，22(5):360-365.

［6］ CHEN T，LI S.Genetic polymorphism at nine STR loci in two ethnic groups of China［J］.Forensic Sci Int，2004，146(1):53-55.

［7］ GILL P，URQUHART A，MILLICAN E，et al．A new method of STR interpretation using inferential logic-development of a criminal intelligence database［J］.Int J Legal Med，1996，109(1):14-22.

［8］ 陈雁，朱宇宁，吕时铭，等.浙江省汉族人群18-STR基因座的分型资料及其应用［J］.中山大学学报(医学科学版)，2010，31(1):122-128.

［9］ 李慧，窦本芝，李铁臣.皖南地区汉族人群21号染色体上2个STRs位点的多态性分析［J］.皖南医学院学报，2010，29(3):169-172.

［10］ HUANGYN，LIAOC，TUXZ，et al．Application of real-time fluorescence quantitative PCR to rapid molecular detection of Down's syndrome［J］.中华医学遗传杂志，2005，22(6):621-623.

［11］王晓丽，宋力.应用短串联重复序列诊断唐氏综合征［J］.天津医科大学学报，2007，13(4):570-572.