皖南地区汉族ICP患者ERα基因多态性的研究

舒 静，何淑凤，李玉红，庞晓楠，李铁臣

(皖南医学院 分子生物学研究室，安徽 芜湖 241002)

妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是一种妊娠中晚期常见的并发症，其产妇主要表现为皮肤瘙痒，血清中转氨酶和胆汁酸水平异常增高，主要危及胎儿，可引起胎儿窘迫、窒息致中枢神经系统缺氧损伤从而引发胎儿宫内死亡及流产［1－2］。目前ICP的发病机理尚不清楚，流行病学研究提示机体内雌激素水平过高可能是ICP的重要诱因，主要证据有:ICP在临床上主要发生于妊娠中晚期，此时正值胎盘合成雌激素的高峰期;使用含雌激素的避孕药物妇女中发生胆汁淤积时的临床表现与ICP的症状十分相似等等［3－4］。雌激素通过与雌激素受体(estrogen receptor，ER)相结合，调节一系列基因的表达。有研究表明ERα基因PvuⅡ多态性在雌激素生理学效应发生中起了重要作用［5］，因此可能与ICP的发生有关。本研究采用PCR-RFLP和DNA测序方法检测ICP患者和正常孕妇中PvuⅡ多态位点的分布情况，探讨ERα基因多态性在ICP发生中的作用。

1 材料和方法

1．1 标本来源和制备 136例标本均来自2009年10月～2012年1月皖南医学院附属弋矶山医院妇产科，其中ICP组43例，年龄22～43岁，平均(26．6±3．6)岁;孕周 30～41周，平均孕(37±2．6)周。正常孕妇组93例，年龄20～40岁，平均(27．8±4．3)岁;孕周 31 ～41 周，平均孕(38．5 ±1．9)周。ICP诊断标准按照《妇产科学》第7版中的标准执行，两组均为居住安徽皖南地区汉族孕妇，均无口服避孕药和接受激素治疗史，也无全身性、遗传性和免疫性疾病(如乙肝，糖尿病等)及其他妊娠期并发症(如妊娠期高血压等)。两组孕妇均抽取2 ml外周血，冻存于－80℃冰柜中，在1～4周内，参考胡卫华等［6］方法制成DNA标本，4℃保存备用。

1．2 聚合酶链式反应(PCR) 引物依照参考文献［7］设计，由上海生物工程有限公司合成，上游序列为 5'-TCCAGGGTTATGTGGCAATGACG-3'，下游引物序列为5'-ACTACCTGCACCAGAATATGTTACCT-3'，扩增片段大小为278 bp，覆盖ERα基因PvuⅡ多态位点。PCR总反应体积50μl:模板DNA为2μl，Taq酶(Tiangen公司)2．5 U，10×buffer(含 Mg2+)5 μl，dNTPs 0．2 mmol/L，上游及下游引物各 10 pmol/L，加灭菌双蒸水至总体积50μl。PCR反应在Mycycler型热循环仪(Bio-Rad公司)上进行，98℃ 5 min蛋白变性后，加入Taq酶，进入热循环，反应条件为:94℃变性30 s，62℃复性45 s，72℃延伸1 min，共33个循环，最后72℃完全延伸4 min。PCR产物4℃保存备用。取10μl PCR扩增产物加样，1．5%琼脂糖凝胶电泳60 min(电压100 V)，溴化乙啶(ethidium bromide，EB)染色，FR-980型凝胶成像仪(上海复日科技有限公司)下检测扩增产物，并摄片保存。

1．3 限制酶酶切 限制性内切酶PvuⅡ为Fermentas公司产品(#ER0631)，反应总体积32μl，包括PCR 产物10 μl，10×buffer 2 μl(10×buffer G)，限制酶PvuⅡ2μl，加灭菌双蒸水至总体积 32μl。37℃水浴2 h，10 μl酶切产物加样，1．5%琼脂糖凝胶电泳(电压100 V)，EB染色，凝胶成像仪下观察结果并摄片保存。

1．4 DNA序列测定 PCR产物50μl连同上下游引物由北京诺赛生物科技有限公司进行PCR产物的纯化和单向测序(双脱氧法)，必要时进行双向测序，观察PvuⅡ多态位点的分布情况。

1．5 数据分析 在SPSS软件包中应用拟合优度χ2检验判断两组PvuⅡ多态性基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，是否具有群体代表性，采用χ2检验比较两组基因型频率以及等位基因频率的分布。

2 结果

2．1 ERα基因PCR产物的鉴定及PvuⅡ酶切和测序结果 所有标本均扩增出278 bp的目标片段，见图1。PvuⅡ酶切产生三种基因型:PP(CC)型(突变型)，产物为278 bp一条带;Pp(TC)型(杂合型)，产物为278 bp、179 bp和99 bp三条带;pp(TT)型(野生型)，产物为179 bp和99 bp两条带，其对应的测序结果中PvuⅡ多态位点序列为CAGCCG、CAGCT/CG(T/C 杂合)和 CAGCTG，见图2、3。

2．2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验 根据Hardy-Weinberg平衡定律用χ2检验分别计算ICP组和对照组3种基因型的期望值、观察值的差异。结果两组的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(ICP组:χ2=5．283，P=0．071;对照组:χ2=2．090，P=0．352)，群体代表性好。

图1 ERα基因PCR产物1．5%琼脂糖凝胶电泳结果

图2 ERα基因PCR产物PvuⅡ酶切结果

图3 PvuⅡ酶切位点测序结果

2．3 ICP组和对照组ERα基因PvuⅡ多态性分析PP型、Pp型、pp型在ICP组和正常孕妇对照组中的分布见表1，经χ2检验，两组间差异无统计学意义(χ2=4．762，P=0．092)，P、p 的基因频率在两组间差异也无统计学意义(χ2=2．385，P=0．122)。

表1 ERα基因PvuⅡ多态性基因型和等位基因在ICP组和对照组中的分布Tab 1 Genotype and allele distribution of ERα gene PvuⅡ polymorphisms in ICP group and control group［n(%)］

3 讨论

ICP是妊娠期危害围生儿健康的并发症，其发病机制尚不明确，目前认为，其发生与雌激素、遗传、环境等因素有关［2］。研究已证明雌激素在ICP发生中起了关键作用，并成功应用雌激素诱出大鼠ICP模型［3，8］。雌激素通过靶细胞膜上ER介导产生生物学效应，因此与ER基因的转录和表达密切相关。ER有ERα和ERβ两种亚型，研究中发现ERα基因敲除的雌鼠体内雌激素等性激素水平降低，不能受孕;而ERβ基因敲除的雌鼠体内雌激素等性激素含量正常或者几乎正常，能受孕［5］。这提示ERα在雌激素生理学活性发挥中起了主导作用，是ER发挥生物学功能的最主要亚型。

ERα基因位于6q25．1，DNA片段大小为140 kb左右，由8个外显子和7个内含子组成［9］，在第1内含子中有1个单核苷酸多态(single nueleotide polymorphism，SNP)位点，可通过限制酶PvuⅡ酶切来检测。研究已证明内含子1中有与基因转录调控密切相关的启动子，增强子等调节序列，因此在其中发生的点突变将严重影响该基因的转录活性，蛋白质的表达以及与雌激素结合活力，最终影响雌激素生物学功能的发挥［10］。目前研究已证实雌激素在ICP的发生中起了重要作用［3］，因此ERα基因的多态可能影响ICP的发生。

ERα基因的多态性与ICP的关系，目前国内外虽有这方面的少量报道，但无进行大样本的研究，ICP病例选取均不超过100例。本研究表明ERα基因PvuⅡ多态在ICP组和正常孕妇对照组中的分布差异无显著性(P ＞0．05)，与芬兰 Eloranta等［11］(ICP组 57 例)，张力等［8］(ICP 组100 例)，梁正仪等［12］(ICP组54例)报道相一致，但不能就此说明PvuⅡ多态与ICP无关，因为上述报道包括本实验都只进行了小样本的研究，要想得出更可信的结果还需扩大样本含量进一步研究。此外ERα基因上有多个多态位点，本实验仅进行了一个常见位点的研究，而且ICP的发生存在明显的地区和种族差异［3］，因此在不同地区和种族进行ERα基因多位点分析对于明确其多态性在ICP发生中的作用是必要的，ERα基因的多态性与ICP的关系还有待于进一步探讨。

本实验先采用PvuⅡ酶切方法进行研究，发现有些标本酶切效果不理想，目标带总是消化不干净存在残留，影响结果的判断。后又使用DNA测序方法进行实验，有些测序图中存在杂峰和底峰同样影响实验结果的准确判断，最后采用先酶切，再与DNA测序结果相比对的方法，提高了实验结果的可靠性。

综上所述，ERα基因的多态性与ICP发生之间的关系尚不明确，需采用扩大研究标本量以及采用限制酶酶切与DNA序列测定相结合的方法作进一步的研究，以明确两者间的关系。

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