不同载体包埋食用菌菌种的实验研究*

李凤美，周永斌，訾惠君，刘连强

（天津市林业果树研究所，天津 300384）

食用菌菌种的包埋是指采用物理方法，将食用菌菌丝体包裹在凝胶的网格结构中或半透性聚合薄膜内，使其保持活性并可反复使用的一种技术。包埋法操作简单，条件温和，包埋后的微环境相对封闭，是目前固定化技术中最有效和实用的一类方法。被包埋的菌种常常用于液体发酵上，生产初级或次级代谢产物，有关研究显示食用菌菌丝体包埋后，相比游离细胞不仅延长了菌种的应用时间，且发酵得到的目标产物均有小幅提高[1-3]。

包埋载体的选择是包埋技术中十分关键的一步，所选择的载体应无毒，不影响细胞代谢，有一定的保水性，成本低，有较高的细胞负载量和活性[4]。本实验选取不同的载体材料对食用菌菌种进行固定化包埋，通过比较载体的机械强度、操作难易、有无毒害、菌株复水活化情况等选出适合的载体，并对包埋剂的浓度、成分配比等进行试验研究，从而确定最适的包埋条件。

1 实验材料

1.1 菌种

所用菌种为本实验室自有的平菇、灵芝、杏鲍菇菌种。

1.2 培养基

PDA综合培养基：马铃薯去皮200 g（加水煮沸20 min，过滤取汁）、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g，水1 000 mL，pH值5.8~6.2。分装，0.1 MPa灭菌20 min。

1.3 实验试剂

海藻酸钠（SA）、聚乙烯醇（PVA）、卡拉胶、明胶、丙烯酰胺单体、N，N'－亚甲基双丙烯酰胺（BIS）、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸钾（K2S2O8）、二醋酸纤维素、2%氯化钙溶液（121℃灭菌30 min）、4%硼酸溶液（121℃灭菌30 min）、丙酮，以上化学试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 菌丝体细胞悬浮液的制备方法

制备PDA液体培养基，分装后121℃灭菌30 min，冷却。各取一小块食用菌母种接种于液体培养基上，25℃摇床上培养15 d，将得到的菌丝体小球用无菌水冲洗、过滤、碾磨，加少量的无菌水制成悬浮液。

2.2 菌种包埋方法

2.2.1 海藻酸钠（SA） 包埋

加热制备3%的海藻酸钠溶液，冷却到40℃后加入少量菌体细胞悬浮液，用针管滴入到2%的氯化钙溶液中，静置3 h～4 h完全硬化，用无菌水洗净制得海藻酸钠包埋小珠。

2.2.2 明胶包埋

加热制备质量浓度为10%的明胶溶液，冷却到40℃后加入少量菌体细胞悬浮液混匀，倒培养皿中铺平板，待其冷却凝固后切成边长4 mm～5 mm的方块。

2.2.3 卡拉胶包埋

加热制备质量浓度为2%的卡拉胶溶液，冷却到40℃后加入少量菌体细胞悬浮液混匀，倒入培养皿中铺平板，待其冷却凝固后切成边长4 mm～5 mm的方块。

2.2.4 醋酸纤维素包埋

取1 g二醋酸纤维素加到15 mL丙酮中，搅拌使之溶解，加入少量菌体细胞悬浮液混匀，用针管滴入无菌水中，形成珠体。

2.2.5 聚丙烯酰胺凝胶包埋

将少量丙烯酰胺单体和N，N'－亚甲基双丙烯酰胺（BIS）溶于水；将菌体细胞悬浮液加入上述混合液中，搅拌均匀；在上述溶液中，加入四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸钾（K2S2O8），室温下放置30 min，使之聚合完全，得到聚丙烯酰胺凝胶；将上述凝胶切成边长4 mm～5 mm的方块，用生理盐水洗净，备用。

2.2.6 聚乙烯醇（PVA） 包埋

将PVA加热溶于水，制备质量浓度为10%的PVA溶液，冷却至40℃后加入少量菌体细胞悬浮液混匀，用针管滴入到4%的硼酸溶液中，静置12 h硬化，取出后用无菌水冲洗备用。

2.3 包埋载体的强度测试

两块载玻片之间放置粒径相近的包埋小球，在上面的载玻片上加100 g砝码，观察小球外形有无变化，看是否有裂痕，是否被压碎来表征小球的机械强度。

2.4 包埋菌株的复水活化试验

将包埋菌种接种到PDA斜面培养基上，25℃恒温培养7 d～10 d，对比观察不同材料包埋菌种的成活情况及菌丝萌发情况。

2.5 包埋载体的优化实验

将聚乙烯醇加热溶于水，制备质量浓度分别为8%、9%、10%的溶液，向上述溶液中分别加入不等量的海藻酸钠，使得海藻酸钠的质量浓度分别为0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%，搅拌均匀，待混合溶液冷却至40℃后加少量菌体细胞悬浮液，将混合液用针管滴入到硬化剂中，硬化剂为2%氯化钙与4%硼酸的混合液，静置10 h，取出，用无菌水冲洗备用。

3 实验结果及分析

3.1 各种载体材料制备包埋菌种的难易情况及表观特征

不同载体制备包埋菌种的难易情况以及表观特征见表1。

表1 不同载体制备包埋菌种的难易情况及表观特征

由表1可知，采用海藻酸钠、明胶、卡拉胶作载体包埋菌种，复水活化后，菌株成活率都在85%以上。但明胶和卡拉胶的机械强度较低，颗粒极易破碎使得被包埋细胞泄出，并且明胶切块时易粘连，不容易操作，卡拉胶虽然不粘连但机械强度太低，因此这2种材料都不适合作菌株包埋的载体。

采用醋酸纤维素和聚丙烯酰胺作载体，虽然包埋颗粒的机械强度高，化学性能稳定，但是菌株复水活化后成活率太低，其原因可能是醋酸纤维素中添加的丙酮对菌株细胞有毒害，而丙烯酰胺单体在形成聚合物网络时，形成条件比较剧烈，对微生物细胞的损害较大。因此这两种材料也都不适合作菌株包埋的载体。

采用海藻酸钠作载体，成球容易，小球形状较为规则，制备操作较为容易，菌株复水后成活率较高，缺点是海藻酸钠机械强度不高。由于海藻酸钠无毒，其溶胶、凝胶过程比较温和，且生物相容性良好，因此常用于作包埋药物、细胞、蛋白的微胶囊载体。

采用聚乙烯醇作载体，其机械强度很高，用100 g砝码挤压被包埋小球，小球外形基本无变化，且对微生物无毒，菌株复水后成活率达80%。存在的问题是聚乙烯醇质量浓度低时无法凝集成球，浓度高时虽能成球，但极易粘连，被包埋小球拖尾现象严重。聚乙烯醇是一种新型的微生物包埋固定化载体，它具有机械强度高、化学稳定性好、抗微生物分解性能强、对微生物无毒、价格低廉等一系列优点，近年来在国内外获得了较广泛的研究[5，6]。

综上可知海藻酸钠和聚乙烯醇两种材料适于做菌种包埋的载体，且两种材料的优势互补，因此可将二者以一定比例混合，进行优化配比，来提高包埋菌种的机械强度，防止粘连，使操作变得容易。

3.2 包埋载体的优化实验结果

PVA-SA混合法制备包埋菌种的操作情况见表2。

从表2中可知，以聚乙烯醇PVA为包埋剂，添加适量的海藻酸钠SA，可防止粘连现象发生，利于载体成球。海藻酸钠的添加量在0.8%最好，不仅促进成球且无粘连。随着海藻酸钠含量的增加，过多的海藻酸钠反而会使载体溶剂黏度增大，粘连现象加剧，固化操作困难，因此选择海藻酸钠SA添加量为0.8%，聚乙烯醇PVA的浓度在10%时，成球较易，球形状规则，无粘连，易操作。

表2 PVA-SA混合法制备包埋菌种的操作情况

实验还发现由于海藻酸钠与聚乙烯醇二者均为亲水性的聚合物，互溶性好，混合制得的材料弹性和柔韧性明显优于单体。同时，海藻酸钠作为一种多糖类天然高分子化合物，对微生物细胞起一定的保护作用，它的引入减轻了硼酸对微生物细胞的毒性作用，提高了固定化细胞的相对活性。

综上选择10%聚乙烯醇并添加0.8%海藻酸钠作为包埋载体，进行食用菌菌种包埋，硬化剂为2%氯化钙与4%硼酸的混合液。

4 结论

用海藻酸钠、聚乙烯醇、卡拉胶、明胶、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺作载体，分别对食用菌（以平菇、灵芝、杏鲍菇为代表）菌种进行包埋实验。通过对载体机械强度、操作难易情况、固定化细胞活性进行对比发现，海藻酸钠和聚乙烯醇两种材料适合作包埋载体，由于二者优势互补，因此将两种材料混合进行优化配比实验，最终确定以10%聚乙烯醇添加0.8%海藻酸钠为包埋剂，对菌株进行包埋，而后滴入2%氯化钙与4%硼酸的混合液进行硬化，可制得固定化菌种。

[1]尚德静.固定化猴头菌细胞的研究[J].食品与发酵工业，2001，28(1)：31-33.

[2]孙亦阳.姬松茸的海绵固定化培养研究[J].广州食品工业科技，2004，20(4)：28-30.

[3]邢小黑，孔小龙.香菇的海绵固定化培养研究[J].食用菌，2001(1)：8-9.

[4]武春艳.两种载体固定化白腐真菌的优化实验及性能比较[J].工业水处理，2011，31(6)：32-35.

[5]姚晶晶.白腐真菌包埋技术研究[J].河南师范大学学报，2011，39(6)：101-105.

[6]刘建红.海藻酸钠、聚乙烯醇包埋固定化技术对紫色非硫光合细菌脱氢酶活性影响的试验研究[J].安全与环境工程，2009，16(3)：54-56.