牡丹‘凤丹’体细胞胚发生技术1)

朱向涛

(浙江农林大学，临安，311300)

王 雁 彭镇华

(国家林业局林木培育重点实验室(中国林业科学研究院林业研究所))

律春燕

(胶州市少海发展管理处)

郑宝强

(国家林业局林木培育重点实验室(中国林业科学研究院林业研究所))

牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)为芍药科芍药属名贵观赏和药用木本花卉，花大而美，有“花中之王”的美誉［1］。牡丹的组织培养已经有大量研究［2-7］，但尚未建立起一套完整的再生体系。体细胞胚胎发生具有数量多、繁殖速度快、结构完整、植株再生率高、不受季节影响等特点，是植物大规模无性繁殖的一种主要手段［8］，有关牡丹体细胞胚发生的研究较少，且体细胞胚诱导率较低［9-11］，对本研究材料‘凤丹’来说，仅在周秀梅［12］论文中有所研究，但体胚诱导率较低，仅为12.5%。本研究以‘凤丹’不同发育时期的合子胚为材料，通过调整培养过程中不同的培养基及培养条件，研究适合牡丹体细胞胚发生的培养基和培养条件，建立牡丹体细胞胚发生体系，为牡丹体胚的产业化生产奠定基础。

1 材料与方法

根据‘凤丹’花后天数，分别选取牡丹种子，采回后放入冰箱内4℃保存备用。分别以种胚、子叶、胚轴为外植体，种子采自中国林业科学研究院花卉中心试验基地。

无菌处理:牡丹种子剥去最外层表皮，用自来水冲洗2 h，洗去表面黏液，之后在超净工作台上用70%酒精灭菌30 s，无菌水冲洗3～5次，然后用2%Na-ClO灭菌20 min，无菌水冲洗3～5次，用无菌滤纸吸干表面水分，之后用镊子和解剖刀剥取幼胚接种到培养基中进行培养。利用上述方法将胚接种在MS+蔗糖30 g·L-1+琼脂7 g·L-1上培养20 d左右，培养后切取胚轴和子叶作为外植体诱导体细胞胚。

分别用花后80、90、100、110、120 d 的牡丹种子种胚诱导体细胞胚，每个时期完成3次重复，采回外植体后立即进行灭菌接种，先后分5次完成试验。

利用种胚、胚轴、子叶等不同外植体对体胚进行诱导，研究不同外植体对体胚诱导的影响，每种外植体完成3次重复，种胚培养如上述方法进行，胚轴和子叶培养在种胚培养20 d后分别获取进行试验。

利用0、30、60、90、120 g·L-1等不同质量浓度蔗糖浸泡种胚2 h，灭菌后接种到培养基上，观察不同蔗糖质量浓度处理对体胚诱导的影响，每个质量浓度完成3次重复。

采用3因素3水平的正交试验设计(表1)，每个培养基组合完成3个重复，用花后110 d的种胚为外植体。每种培养基加入蔗糖30g·L-1，琼脂7 g·L-1。

表1 正交试验设计

培养基配制与灭菌:种胚发育时期、不同外植体、不同质量浓度蔗糖等因素对体胚诱导影响的研究均接种在 MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1+蔗糖 30.0 g·L-1+琼脂 7.0 g·L-1培养基上，黑暗条件下培养20 d后转到光暗交替(光照∶黑暗=12 h∶12 h)条件下培养，接种后70 d观察试验结果。所有培养基的pH值为5.6～5.8。

培养条件及培养过程:中国林业科学研究院花卉中心组培室，温度20～25℃，光暗交替条件下，光照强度为 30～40 μmol·m-2·s-1。刚接种后在黑暗条件下培养20 d，之后转入光暗交替条件下进行培养。每周观察1次种胚的生长情况，及时剔除污染植株并记录。每隔30 d转接1次。

培养1周后观察外植体污染情况，记录数据，计算污染率和褐化率，诱导70 d后统计产生体细胞胚的外植体的数目，统计体细胞胚诱导率，所有数据利用Excel进行统计，利用spss17.0针对胚发育时期、不同外植体、蔗糖处理不同时间等因素对体细胞胚发生的影响进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 发育时期对‘凤丹’体胚发生的影响

不同发育时期种胚的发育情况不同，从表2可以看出，部分种胚接种到培养基后无明显生长，保持原有胚的形态不变，随着种胚成熟度的增加，无生长的现象逐渐降低，在花后120 d和花后110 d种胚无生长现象较低。污染数量随生长期延长呈现逐渐降低的趋势，花后80 d的外植体污染数最多，而花后120 d的外植体无污染。不同时期种胚生长的部位不同，随着种胚成熟度的增加，胚根伸长的个数都有所增加，在花后110 d胚根伸长数达到最大。而在花后80 d，胚根伸长数最少。子叶生长数量随着花后时间的延长而呈现先增加后减少的变化趋势，在花后110 d子叶生长数达到最大，而花后80 d子叶生长数最小。体胚诱导数随着花后生长时间的延长呈现先升高后降低的变化趋势，在花后110 d达到最高，诱导数为13.00个，而在花后80 d体胚诱导数仅为5.00个。可见体胚诱导选择发育时期在花后110 d的种胚诱导效果最好，体胚发生率最高，为33.00%。每个发育时期都能诱导出体胚，但不同时期诱导率有所差异。

表2 合子胚的发育时期对‘凤丹’体胚发生的影响

方差分析可以看出，体胚发生率与发育时期具有一定的相关性，体胚发生率随着种胚成熟度的增加而增加，在花后100、110、120 d 3种成熟度体胚诱导率没有显著性差异，而花后80、90 d体胚发生率差异性不显著，但花后80 d和90 d与其他3个时期体胚发生率差异性显著。从表2可以看出，花后100 d为体细胞胚诱导的界限，体细胞胚发生率在100 d前后呈现显著性差异，因此，在体细胞胚诱导过程中，选择花后100 d以后的种胚更有利于体细胞胚发生，而相比较而言，110 d的种胚诱导体细胞胚的个数最多，因此，选择花后110 d的种胚最好。

2.2 外植体类型对牡丹‘凤丹’体胚发生的影响

外植体类型不同体胚诱导效果有所不同，总体上来看，利用种胚、胚轴和子叶均能诱导出体细胞胚，但诱导率差异显著(表3)。

表3 外植体类型对‘凤丹’体胚发生的影响

从表3可以看出，3种不同的外植体类型，体胚诱导率有所不同，总体上看，种胚的体胚诱导率最高，而胚轴的诱导率次之，子叶的诱导率最低，最高诱导率为33.00%，而最低的诱导率为8.00%。方差分析可以看出，种胚的体胚诱导率与其他2种外植体的差异显著，而胚轴和子叶的体胚诱导率差异不显著。在利用种胚诱导体细胞胚的过程中，利用种胚直接诱导要好于利用胚轴和子叶进行诱导。

试验过程中发现，种胚在产生体细胞胚的过程中会发生颜色和形态的变化，最初将胚接种在培养基上时，胚呈现白色，2片小子叶紧密结合(图1A)，之后胚2片小子叶开始慢慢开口(图1B)，此时，胚颜色仍为白色，之后在培养基中营养的作用下，胚的体积逐渐增加，子叶开始慢慢长大，而胚根部位慢慢变粗，整个胚的颜色仍为白色，但颜色稍微加深，呈现乳白色(图1C)，之后，随着生长子叶的边缘呈现浅红色斑点，而在子叶的基部呈现浅绿色，整个胚呈现淡黄色(图1D-E)。之后种胚的子叶部分开始变绿，而胚轴部分只是增粗，颜色未发生变化，仍然为白色，子叶不断伸长，生长到一定程度后，停止伸长靠近培养基的一片子叶生长缓慢，远离培养基的一片子叶生长较快，胚基部出现浅红色或白色透明愈伤组织(图1F)，此时可以进行胚轴和子叶分离分别培养。随着培养时间的延长，在胚轴部位开始出现体细胞胚的结构(图1G-H)。对种胚经过20 d培养后形成的组织(图1I)进行切割，将胚轴和子叶分开培养，诱导体细胞胚。结果表明，胚轴和子叶在接种到诱导培养基上后，容易形成愈伤组织(图1J)，通过愈伤组织诱导进一步形成体细胞胚(图1K-L)。

2.3 不同质量浓度蔗糖预处理对牡丹体细胞胚发生的影响

从表4可以看出，对照试验的体细胞胚发生率较低，随蔗糖质量浓度的提高，体细胞胚的诱导率呈现先升高后降低的变化趋势，在质量浓度为90 g·L-1时，体细胞胚的发生率达到最高的38.00%，而未经蔗糖处理的体细胞胚的发生率为32.50%，方差分析可以看出，各种质量浓度的蔗糖处理体细胞胚发生率的差异不显著。但可以看出利用蔗糖预处理要比没有经过预处理的效果要好。因此，利用花后110 d的种胚诱导体细胞胚时，最好用90 g·L-1的蔗糖溶液处理2 h后再进行接种，有利于促进体细胞胚的产生。

2.4 培养基类型对体细胞胚诱导的影响

从表5中可以看出，所有培养基上都能诱导出体细胞胚，但是不同培养基诱导体细胞胚的数量不同，诱导率差异较大，总体上看，2号培养基诱导效果最好，体胚诱导率达到38.33%，其次是3号培养基。而7号培养基的诱导率最低，为15.83%。从方差分析可以看出，2号培养基与其他各培养基差异显著。因此，2号培养基 MS+2，4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+琼脂 7.0 g·L-1是最佳培养基。其他各个培养基之间差异性不显著。

表4 不同质量浓度蔗糖预处理对‘凤丹’体胚发生的影响

表5 不同诱导培养基对牡丹‘凤丹’体胚发生的影响

表6 各因素极差分析

从各因素极差分析表(表6)中可以看出，对于体细胞胚诱导率，3因素中极差最大的是A(培养基)因素，为0.102，因此，为主要影响因素，而 B(2，4-D)为次要影响因素，极差最小的是C(6-BA)，为0.036，影响因素效果最小。所以，不同培养基对牡丹体细胞胚诱导的影响效果最大，而影响因素最小的是植物激素6-BA。从最大值上看，A因素的第1水平、B因素的第2水平和C因素的第2水平值最大，从而得出，各种因素的最优组合为A1B2C2。即各种因素的最佳组合是MS+2，4-D 2.0 mg·L+6-BA 2.0 mg·L-1，此组合为2号培养基组合。

对不同培养基的方差分析可以看出，3种培养基中，MS培养基是最好的培养基，而DKW和WPM比MS效果稍差，且两者差异不显著，而MS与后2种培养基差异性极显著。2，4-D的不同质量浓度中，随着质量浓度的提高，体胚诱导率呈现先升高后降低的变化趋势，在质量浓度为2.0 mg·L 时效果最好，与其他2个质量浓度存在极显著差异。而6-BA的质量浓度是3个影响因素中影响最小的，但是在不同质量浓度的变化中依然有差异，在质量浓度为2.0 mg·L-1时效果最好，与其他2个质量浓度存在极显著差异。

图1 体细胞胚形成过程

3 结论与讨论

试验结果表明，3种外植体中，种胚的诱导率最高，是最适合诱导体细胞胚的外植体。有关牡丹组的体细胞胚诱导前人也有研究，何桂梅［13］利用‘连鹤’‘岛锦’花后70 d的胚进行体细胞胚的诱导，诱导率均在30%以下，而利用‘凤丹’诱导体细胞胚诱导率仅为10%，本试验结果诱导率更高。

Shin J H et al. 利用芍药的种胚在常规培养基MS上预培养后，取子叶做外植体，在不同的诱导培养基上培养，获得了不同的诱导效果。不同的培养基对子叶诱导效果有所不同，诱导率也有较大差异，因此，针对不同的外植体采用不同的植物激素和基本培养基组合，筛选合适的培养基是有必要的。

利用质量浓度为90 g·L-1的蔗糖溶液处理种胚2 h，体细胞胚诱导效果最好。前人有多次利用蔗糖预处理外植体而提高体细胞胚诱导率的研究，Biahoua A et al.［15］研究不同类型的糖对欧洲卫矛体细胞胚诱导的影响表明，蔗糖作为重要的渗透调节物对体细胞胚的诱导和发育都有重要作用。Zhou S J et al.［16］对北美人参进行蔗糖预处理，能够提高体细胞胚诱导率，减少畸形胚发生的概率，主要原因可能是蔗糖处理后的高渗透压使细胞质壁分离现象发生，从而促进体细胞胚的产生，具体原因有待进一步研究。而 Sujatha M et al.［17］对向日葵的体胚发生研究也发现，随蔗糖质量浓度升高，体胚诱导率提高，以质量浓度为120～210 g·L-1的诱导率最高。对向日葵体胚分化最合适的蔗糖质量浓度是120～180 g·L-1，高于 180 g·L-1或低于 120 g·L-1的体胚均发育慢。达克东等［18］对苹果离体叶片进行体细胞胚诱导认为，在碳源供应充足的情况下，适当降低蔗糖质量浓度有利于直接体胚的发生。由前人研究可以看出，不同的植物对蔗糖处理的反应不同，本试验结果表明，利用质量浓度为90 g·L-1的蔗糖处理浸泡牡丹种胚2 h对体细胞胚诱导效果最好。

几种培养基中，MS是最适合诱导体细胞胚的培养基。WPM培养基和DKW培养基是中等养分的培养基，其中NH4NO3的质量浓度较低，是适合木本植物组织培养的培养基。从试验结果来看，后2种培养基对牡丹体细胞胚的诱导作用不理想，这说明牡丹体细胞胚培养可能需要高质量浓度的NH4NO3，但是高质量浓度的NH4NO3不利于培养外植体的酚类物质的扩散，这可能是在MS培养基上褐化相对严重的原因，尤其是在子叶和胚轴培养上，效果更明显，在完整体胚的培养上，由于没有对外植体进行切割，所以褐化的情况较少。

本试验以2，4-D和6-BA2种植物生长调节物质为基础，按照不同质量浓度梯度进行设计，均诱导产生了体细胞胚，但诱导率有差异，试验结果表明，MS培养基是合适的培养基，而在2种植物生长调节物质质量浓度均为2.0 mg·L-1时，体胚诱导率最高。

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