啤酒酵母与葡萄酒酵母甘油生成动力学的研究

徐 扬，杨 霄，安 家 彦

（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引言

甘油是酒精发酵生产中主要副产物之一。近年来许多学者在酵母细胞的甘油代谢及生理功能方面开展了深入的研究。甘油为非挥发性物质，它的黏性和甜味可使酒具有圆润、柔滑、更易入口的特性，也可用于平衡酒中的酸感，增加口感复杂性，是高品质酒的重要成分［1］。在酒精发酵过程中多产甘油有利于提高葡萄酒的质量［2］。

本研究旨在对啤酒、葡萄酒生产用酵母发酵酒精的条件下生成甘油的动力学关系进行研究，了解其甘油在酵母发酵过程中的变化趋势，可以估计发酵生产中甘油的含量，以提高酒的质量。同时对酒精生产酵母的甘油生成关系进行比较，以期获取甘油生成的共性关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌 种

啤酒酵母、葡萄酒1＃酵母、酒精酵母，均为本实验室保藏菌种。

1.1.2 培养基

种子培养基：葡萄糖20g/L，玉米浆5.0g/L，自来水配制，pH 自然，121 ℃灭菌20min。

发酵培养基：玉米浆2.0g/L，葡萄糖120g/L，pH 自然，121 ℃灭菌20min。

1.2 实验方法

从菌种斜面刮取菌落一环，接种于种子培养基中，30 ℃、20r/min培养48h，按10%接种量接种于发酵培养基中30℃静置培养，并间隔一定时间取样测定。

1.2.2 生物量的测定

取0～0.500g 的梯度称取酵母泥定容至1 000L，在560nm 处测吸光度。同时取相同量的酵母泥于事先称量好的平皿中放置于烘箱中80 ℃烘干，时间为5h，测量出酵母泥的干重。以酵母干重为纵坐标、吸光度为横坐标绘制酵母干重的标准曲线。发酵液离心后，将酵母泥定容到100mL容量瓶中，在560nm 处测出吸光度，通过标准曲线得出酵母干重。

1.2.3 还原糖的测定

采用3，5-二硝基水杨酸光度法［3］测定还原糖。

1.2.4 甘油的测定

本次研究所涉及到的数据都通过SPSS18.0进行统计分析，计量资料表示为±s，进行t检验；计数资料表示为百分率（%），予以χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

（1）采用高碘酸氧化法［4］。

（2）由于发酵液中的残糖与高碘酸反应，为除去干扰，根据“（1）”的方法绘制葡萄糖干扰曲线，从而用已知残糖的浓度来获得残糖所消耗NaOH 溶液的体积（V2）。

（3）甘油质量浓度按式（1）计算。

式中，n为取液量（mL），n=2；c为NaOH 标准溶液浓度（mol/L）；V1为发酵液消耗的总的NaOH溶液的体积；V2为发酵液中残糖消耗的NaOH溶液的体积。

1.2.5 葡萄糖干扰曲线的测定

分别配制0、15、30、45、60、75g/L 的标准葡萄糖溶液。以蒸馏水作为空白样，取样品2 mL于三角瓶中，加水10 mL，加入酚酞指示剂，用0.1mol/L NaOH 标准溶液滴定至变色。然后加入10 mL 0.1 mol/L 高碘酸钠溶液，避光反应5min，再加入25%乙二醇溶液5 mL，避光反应5min。然后用上述NaOH 标准溶液滴定至变色，变色程度应与前次变色程度相当，记录所用NaOH 溶液的体积。

根据每个标准葡萄糖溶液所消耗的NaOH溶液的体积（V2）为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制葡萄糖干扰曲线。

2 结果与分析

2.1 发酵实验结果

啤酒酵母、酒精酵母、葡萄酒1＃酵母在12%的葡萄糖培养基下发酵的实验结果如图1～3。由图1～3 可知，本研究使用的几株酒精发酵酵母，生成甘油过程属于生长部分偶联型。

2.2 动力学模型的建立

2.2.1 菌体生长模型

Verhulstl提出在某一特定环境条件下，应有一最大的细胞质量浓度，它相当于生物学中的负载能力［5］，利用上述概念提出了Logistic方程，在该方程中将比速率与尚未利用的负载能力相关联，即在生长期细胞的增长速率可以用下式表达

图1 啤酒酵母发酵过程曲线Fig.1 Beer yeast fermentation process curve

图2 葡萄酒1＃酵母发酵过程曲线Fig.2 Wine yeast fermentation process curve

图3 酒精酵母发酵过程曲线Fig.3 Alcohol yeast fermentation process curve

式中，μm 为细胞生长最大比速率，h-1；Xm为细胞质量浓度最大值（干质量），g/L；X为酵母质量浓度（干重），g/L；t为时间，h。

将式（1）积分得

用Origin Pro 8.1软件对菌株生长方程进行拟合，其酵母生长动力方程拟合参数如表1所示。

2.2.2 乙醇发酵中甘油生成动力学

以Luedeking-Piret关系式［6］来描述产物形成与细胞生长的关系。

表1 酵母生长动力学方程拟合参数Tab.1 Yeast growth dynamics equations of fitting parameters

由图1～3可以看出，甘油合成与细胞生长属于部分偶联型，因此选用Luedeking-Piret方程公式（4）对甘油的生成进行动力学分析［7］。

将式（4）积分得

式中，ρ为t时的甘油质量浓度；ρ0 为0时刻的甘油质量浓度；α为与生长相关联的甘油形成系数，g/g；β为非生长相关联的甘油形成系数，h-1。

实验数据用软件Origin Pro 8.1对式（5）进行非线性拟合，拟合后见表2。

表2 甘油生成的动力学方程拟合α、β值Tab.2 Glycerin generate the dynamic equations of fittedα，βvalues

由表2可知β远比α小，可以忽略不计。于是甘油生成与细胞生长可以近似于生长偶联型，可以用Logistic方程直接进行拟合。

式中，ρ0 为0时刻的甘油质量浓度；ρ为甘油生成质量浓度，g/L；ρm 为甘油质量浓度最大值，g/L；μpm为甘油生产最大比速率，h-1。

式中，ρ0、ρm、μpm等为需拟合参数。其拟合曲线与实测值曲线见图4。

3 结论

图4 种酵母产甘油的实验值与拟合值比较Fig.4 Three kinds of yeast production of the experimental value of glycerol and fitting value comparison

研究表明用Logistic方程可很好地描述啤酒生产酵母、葡萄酒1＃酵母的生长动力学关系；其甘油生成关系用Luedeking-Piret方程回归，其常数α远大于β，说明甘油生成符合酵母生长的偶联型模型，以偶联型回归具有很好的相关性（R2均大于0.97）；实践中的甘油生成与酒体的圆润有关，发酵前期为酵母生长速率的高低会直接影响甘油生成速率的高低；实验中比较了酒精生产酵母的甘油生成关系，其与啤酒生产酵母、葡萄酒1＃酵母的动力学关系是一致的。