人参皂苷葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及包涵体的变复性
2012-09-18马明飞，李树金，金凤燮，鱼红闪
马 明 飞，李 树 金，金 凤 燮，鱼 红 闪
（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034）
0 引言
人参中的主要有效成分是人参皂苷［1］，但含量较高的皂苷成分不一定是活性最高且结构最佳的，而稀有皂苷含量极少，却易被人体吸收，并且具有更高的生理活性。人参皂苷葡萄糖苷酶可以将人参中含量高的皂苷转化为活性更高的微量成分皂苷。关于人参皂苷葡萄糖苷酶的报道，多来自于本实验室，国内外相关的研究较少。本实验室长期研究能水解人参皂苷糖基的、特异的人参皂苷糖苷酶类［2］，并筛选出产人参皂苷葡萄糖苷酶的微生物Absidiasp.G8r，又对人参皂苷葡萄糖苷酶进行了分离、纯化，并研究了其基本的酶学特性［3-4］。但是从分子生物学水平上研究人参皂苷葡萄糖苷酶基因的克隆和表达，国内外尚未见报道。本实验室前期已成功从产人参皂苷葡萄糖苷酶的微生物Absidiasp.G8r菌中调取出了人参皂苷葡萄糖苷酶的基因全序列，全长为2 149bp，CDS区全长为1 923bp，共编码640个氨基酸，理论分子质量约为71ku［5］。本实验将编码人参皂苷葡萄糖苷酶成熟肽的cDNA 片段克隆到大肠杆菌表达载体pET32a（+）中，构建了含有人参皂苷葡萄糖苷酶基因的重组质粒。将该重组质粒转化至E.coliBL21（DE3），通过对重组蛋白进行变性、复性处理，进行了薄层层析法和SDSPAGE 法的定性和定量分析，进一步确定了所调取的人参皂苷葡萄糖苷酶基因序列的正确性。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 菌株和质粒E.coliBL21（DE3）和pET32a（+），购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.1.2 试剂与工具酶
限制性核酸内切酶、低分子质量蛋白Marker、Takara Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、Takara DNA Ligation Kit均购自宝生物工程（大连）有限公司。IPTG 购自北京欣经科技生物技术有限公司。
1.1.3 仪器与设备
HimacCF15R 型高速冷冻离心机，JM-250型电泳仪，2816 型快速离心机，UV-120-02 型分光光度计，SK-1型快速混匀器，BCD-272AY 型容声冰箱。
1.2 方 法
1.2.1 目的基因的扩增
根据Genbank中人参皂苷葡萄糖苷酶基因序列，设计引物（CTC747F：5′-GAATTCGAGGCGCACGCTGGGAGAACA-3′；CTC747 R：5′-AAGCTTCTACTTCAGAGACAGCCAGGAGA-3′）。使用High Fidelity PrimeScriptTMRTPCR Kit进行RT-PCR。PCR 循环参数为：94 ℃3min；98 ℃10s，55 ℃15s，72 ℃2 min，进行30个循环；72℃10min。采用1%的琼脂糖凝胶电泳，检测目的基因，回收纯化目的条带，与载体pMD19-T Simple Vector连接后，将重组质粒热转化至E.coliCompetent Cells JM109 中，涂布于LB 平板，在37 ℃条件下过夜培养，挑取阳性菌落，提取质粒测序。
1.2.2 载体与目的片段的酶切与回收
使用EcoRⅠ和NotⅠ对pET32a（+）表达载体及目的片段进行双酶切，酶切后分别作为载体和DNA 插入片段。采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0切胶回收载体以及目的片段，分别取1μL进行琼脂糖凝胶电泳。
1.2.3 连接与转化
使用TaKaRa DNA Ligation Kit试剂盒中的连接酶，连接酶切后的载体和目的片段后，热转化至E.coliCompetent Cells JM109 中；重组体涂布于LB平板，37 ℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌，提取质粒进行双酶切鉴定以确认目的片段是否插入。将阳性的重组质粒热转化至宿主细胞E.coliCompetent Cells BL21（DE3）中，重组体涂布LB平板，于37 ℃过夜培养。提取阳性菌落的质粒进行双酶切，对其进行鉴定。
1.2.4 目的蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
挑取阳性重组质粒，于含100μg/mL Amp的TB液体培养基中，在37 ℃条件下振荡过夜培养。次日以1∶50的比例进行稀释扩培，在37℃振荡条件下培养至OD600达到0.6～1.0后，加入诱导剂IPTG（最终浓度为0.5 mmol/L），在30 ℃诱导培养4h。对重组蛋白进行SDS-PAGE检测，以确定是否表达。
1.2.5 表达产物的变性和复性
4 ℃、10 000r/min离心15min，收集诱导后表达菌体，将其重悬于PBS（pH 7.4）缓冲液中，4 ℃、10 000r/min离心15min洗涤两次。向清洗后的沉淀中加入10mL 细胞裂解液，48μL 溶菌酶（至100μg/mL），0.1%TritonX-100 50μL，室温下静置30 min。然后在冰浴条件下进行超声裂解，至不再黏稠。超声条件为：功率300 W，超声2s，静置5s。4 ℃、10 000r/min 离心15min，收集上清和沉淀，SDS-PAGE 检测，沉淀为以包涵体形式表达的目的蛋白。
将包涵体溶解于pH 7.5的8mol/L 尿素溶液中，在室温下振荡1h 以充分溶解包涵体。4 ℃、12 000r/min 离心15 min，将上清液以1∶40的比例稀释到复性液（pH 7.5，5% 甘油，500μg/mL PEG，20μg/mL NaCl，0.035%β-巯基乙醇）中，4 ℃下搅拌1h，然后4 ℃下过夜复性。复性后离心，复性液与0.05%的Rb1溶液按体积比1∶1混匀，在40 ℃下反应24h后，加入饱和正丁醇终止反应，进行TLC活性检测。
2 结果与讨论
2.1 目的基因的扩增及载体与目的片段的酶切鉴定
经PCR 得到了长度约为1.9kb 的扩增产物，与预期大小一致。采用“1.2.1”的方法对载体与目的片段进行酶切与回收，取1μL 进行3%琼脂糖凝胶电泳后，结果如图1所示。
pET32a（+）经双酶切后的大小与理论值相符，约5.9kb，结果见图2。插入片段经双酶切后与目的基因全长大致相符，约为1.9kb，证明PCR 扩增产物经双酶切后为目的片段，可进一步将酶切目的蛋白和酶切载体进行连接。
图1 PCR 扩增目的基因序列Fig.1 Amplification of insert DNA by PCR
图2 目的片段与载体的酶切结果Fig.2 Insert DNA and vector digested with enzymes
2.2 重组质粒的构建与酶切鉴定
酶切载体和酶切目的片段经连接酶连接后，热转化至E.coliCompetent Cells JM109 中，将热转化后的重组体涂布于LB平板，在37 ℃条件下过夜培养。挑取阳性菌落，提取质粒进行双酶切后，取1μL 进行3%琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。
图3 重组质粒的酶切电泳图Fig.3 Electrophoresis of recombinant plasmid digested with enzymes
泳道1 相对应的pET32a（+）载体片段为5.9kb的；泳道3 为1.9kb 的插入DNA片段。泳道2为重组质粒经双酶切后的结果，重组质粒由一个大小约5.9kb的pET32a（+）载体片段和1.9kb的目的基因片段组成。酶切鉴定结果表明目的片段已经插入，重组质粒构建成功。
2.3 重组质粒转入宿主菌
阳性重组质粒热转化至E.coliCompetent Cells BL21（DE3）中，重组体接种于LB 平板上，于37 ℃条件下过夜培养。挑取阳性菌落的质粒进行双酶切鉴定。片段大小与预期一致，表明外源基因已稳定地整合入大肠杆菌中。结果如图4所示。
图4 重组转化子的酶切电泳图Fig.4 Electrophoresis of recombinant digested with enzymes
2.4 人参皂苷葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的诱导表达
重组菌经诱导表达后，进行SDS-PAGE 检测。如图5 所示，结果显示经过诱导的样品在75ku有一条差异条带，其分子质量与理论值基本相符，证明了重组蛋白在大肠杆菌中得到表达。对菌体进行细胞裂解、离心后分别将上清和沉淀部分进行SDS-PAGE检测。从图5中可看出，于上清液中并未检测到目的蛋白，而在沉淀中发现有目的蛋白存在，说明该目的蛋白以包涵体形式表达。
图5 重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant protein
2.5 包涵体的变性和复性以及酶活性检测
采用“1.2.4”的方法对包涵体进行变性和复性处理后得到重组蛋白，对其进行TLC 活性检测。经过变性和复性处理后的样品能够水解底物Rb1，说明其具有人参皂苷葡萄糖苷酶的活性。结果如图6所示。
图6 变复性后的薄层层析图Fig.6 TLC of refolded inclusion body
3 结论
本实验成功构建了含有人参皂苷葡萄糖苷酶基因的重组表达质粒并转化至E.coliBL21（DE3），宿主菌经IPTG 浓度诱导，产生了以包涵体形式表达的重组蛋白。通过对重组蛋白的SDS-PAGE分析，确定了表达的重组蛋白为人参皂苷葡萄糖苷酶。但是为了获取有活性的重组蛋白，需要将包涵体中的重组蛋白变性溶解处理，然后进行稀释复性处理，使重组蛋白分子重新折叠形成正确的空间结构。本实验对复性方法和变性剂及复性剂的筛选，最终选用8mol/L 尿素作为变性剂将重组蛋白溶解并充分变性，选用含有甘油、聚乙二醇、氯化钠和β-巯基乙醇的复性剂进行稀释复性，形成具有生物活性的人参皂苷葡萄糖苷酶蛋白。这进一步证明了以前提取的人参皂苷葡萄糖苷酶基因的正确性，也为研究在原核微生物中表达真核基因提供了科学依据。
