青钱柳愈伤组织增殖1)

2012-09-18谢寅峰张志敏张颖颖尚旭岚方升佐

东北林业大学学报 2012年6期

谢寅峰张志敏张颖颖孙朦尚旭岚方升佐

(南京林业大学，南京，210037)

青钱柳(Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja)又名摇钱树、麻柳、青钱李等，系胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属植物，是我国特有的珍稀单种属植物，国家重点保护濒危植物之一，青钱柳为多用途树种，具药用、材用和观赏价值［1－2］。目前，现有的青钱柳资源主要是天然林，不仅数量少，而且多零星散布于深山老林和一些自然保护区中。青钱柳由于种子败育并具有深休眠等诸多因素造成其繁殖较困难［3］，国内外尚无大量人工繁殖和栽培青钱柳的成功经验，相关方面的研究报道也较少。愈伤组织可以作为研究植物脱分化和再分化、生长和发育、遗传和变异、育种及次生代谢物生产的理想材料［4］，因此获得大量愈伤组织也成为目前开发利用青钱柳资源的一个重要研究方向。

为了获得大量状态较好的青钱柳愈伤组织，本文在前期愈伤组织诱导研究的基础上［5］，进一步从基本培养基、蔗糖浓度、植物生长调节剂、稀土应用等方面对愈伤组织增殖条件进行探讨，研究结果为后续次生代谢调控、高效组培快繁体系建立等方面的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

采自江苏镇江南京林业大学教育基地。取3年生青钱柳幼树当年生的嫩枝作为外植体，以嫩叶作为诱导愈伤组织的材料。愈伤组织诱导培养基及培养条件见文献［5］。

1.2 增殖基本培养基的筛选

采用单因素设计，采用WPM、改良DKW(硼酸减为1/3，VB1和甘氨酸增加1倍)、MS、改良 MS(3/4MS)、DY、B5等6种培养基进行增殖试验。添加2 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6.5 g/L琼脂(国药集团化学试剂有限公司产品)，pH调至5.8。每个处理接种6瓶，重复3次。接种后定期观察，记录愈伤的颜色状态，20 d后收获测鲜重增量和增长率。

1.3 蔗糖质量浓度对愈伤组织增殖的影响

以改良MS 为基本培养基，添加20、30、40、60 g/L 蔗糖，附加2 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA+6.5 g/L琼脂，pH调到5.8。每个处理接种6瓶，重复3次。接种后定期观察，记录愈伤的颜色状态，20 d后收获测鲜质量增量和增长率。

1.4 植物生长调节剂及其浓度对愈伤组织增殖的影响

增殖培养的植物生长调节剂的种类及其浓度，采用 KT、2，4－D、NAA 三因素［6］，三水平 L9(33)正交试验设计，KT 分别为 0.2、0.5、1.0 mg/L，2，4－D分别为0.2、1.0、2.0mg/L，NAA分别为0.0、0.1、1.0 mg/L。以改良MS为基本培养基，添加30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂，pH调至5.8。每处理接种5瓶，重复3次。接种后定期观察，20 d后收获测鲜重增量和增长率。

1.5 稀土对愈伤组织增殖的动态影响

以改良MS为基本培养基，添加不同质量浓度的稀土(硝酸镧，La(NO3)3)。质量浓度梯度分别设为0、0.1、0.5、1、2、5、10、20、40、50 mg/L。附加 2 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA+6.5 g/L 琼脂，pH 调到5.8。每个处理接种6瓶，重复3次。接种后在20 d后测愈伤组织生长量，统计增长率，记录愈伤的颜色状态。

1.6 观察、统计与数据分析

愈伤组织增长量和增长率用鲜质量增加计算法(g/瓶):

以上数据为6瓶的平均值，重复3次。

试验数据利用Excel，STST统计分析软件进行处理，并用Duncan氏法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 基本培养基对愈伤组织增殖的影响

表1结果显示，不同基本培养基对青钱柳愈伤组织的增值和生长有不同程度的影响。生长量增量最大的是MS培养基，其次为WPM和改良DKW，差异不显著(p＞0.05);从增长率来看，WPM培养基最佳，其次是改良DKW和MS，差异不显著(p＞0.05);但从愈伤组织的颜色和状态看，MS和改良MS效果最好，大多为淡绿色，质地较松散，WPM培养基的愈伤组织部分出现褐色，质地较硬。综合以上3个因素，MS培养基为最佳选择。

2.2 蔗糖质量浓度对愈伤组织增殖的影响

表2结果表明，培养基中添加20～60 g/L的蔗糖，随着蔗糖质量浓度的增加，愈伤组织生长量的增量和增长率均呈下降的趋势，20 g/L时增长率最高，60 g/L时增长率最低，20 g/L处理与其它质量浓度处理间差异显著。但从愈伤组织的颜色和状态看，蔗糖质量浓度为30 g/L时效果最佳，淡绿色，质地较松散，有利于继代培养。

表1 基本培养基对青钱柳愈伤组织增殖的影响

表2 不同质量浓度的蔗糖对青钱柳愈伤组织增殖的影响

2.3 植物生长调节剂及其质量浓度对愈伤组织增殖的影响

三因素三水平正交试验结果表明，不同激素及浓度配比对青钱柳叶片愈伤组织的增殖有不同程度的影响作用。其中，KT0.2 mg/L+2，4－D0.2 mg/L组合效果最佳，平均增量和增长率都达到最高，分别为3.48 g和1024.51%，和其他处理相比均达极显著差异(p＜0.01)。极差分析结果表明，三因素(KT、2，4－D、NAA)的 R 值分别为 267.74、346.08、103.34，说明三种激素对愈伤组织增殖的影响效果为2，4－D＞KT＞NAA，2，4－D 为影响增殖效果的主导因素。从愈伤组织的颜色和状态看，随着2，4－D质量浓度的增大，愈伤组织分裂快、质地疏松，但平均增量和增长率明显下降，愈伤组织颜色由淡黄、白等浅色逐渐加深成褐、黑色。KT质量浓度高时愈伤组织较致密，颜色鲜嫩。综合各组合测定结果发现，愈伤组织的增殖不仅与植物生长激素的绝对量有关，还与生长激素与细胞分裂素的比例有关。当生长素/细胞分裂素为1∶1左右时(如组合KT0.2 mg/L+2，4－D0.2 mg/L 和 KT1.0 mg/L+2，4－D1.0 mg/L)，愈伤组织的增长量较大;当生长素/细胞分裂素为2 ∶1 左右时(如组合 KT1.0 mg/L+2，4－D2.0 mg/L+NAA0.1 mg/L)，愈伤组织的增长量(0.45 g)及增长率(108.80%)最低，和其它处理相比达极显著差异(p＜0.01)。

2.4 稀土对愈伤组织增殖的影响

表3结果表明，随着培养基中添加镧稀土质量浓度的增加，对愈伤组织增殖的影响总体上呈现先促进后抑制的效应。当镧稀土质量浓度为0.5 mg/L时，愈伤组织的增殖效果最佳，和其他处理相比均达显著差异(p＜0.05)。随着镧稀土质量浓度的增加，愈伤组织增长率呈下降趋势，从愈伤组织的颜色和状态看，镧稀土质量浓度为0.5 mg/L时效果最佳，淡绿色，质地较松散，有利于继代培养。结果表明培养基中添加适宜质量浓度的稀土能有效促进愈伤组织的生长，而浓度过高则对愈伤组织的增殖起抑制作用。

表3 镧稀土对青钱柳愈伤组织增殖的影响

3 结论与讨论

培养基是植物组织培养的物质基础，基本培养基的种类对愈伤组织的增殖产生一定的影响［7］。本试验结果表明，虽然从愈伤组织增长率来看，WPM培养基最佳。但从愈伤组织的颜色和状态看，MS和改良MS效果最好，大多为淡绿色，质地较松散;而WPM培养基的愈伤组织部分出现褐色，质地较硬。

蔗糖是大多数植物细胞生长的最适碳源，它的吸收和利用直接影响细胞生长和产物合成。在B5培养基中添加2%的蔗糖最适合东北红豆杉愈伤组织增殖，愈伤组织长势旺盛。以不同质量浓度蔗糖作为碳源进行茶细胞培养时，随着蔗糖含量的增加，愈伤组织生长逐渐上升，到6%时生长最好，随后下降［8］。本实验结果显示，蔗糖质量浓度对青钱柳愈伤组织生长亦有明显的影响，质量浓度为20 g/L时效果最佳，增长率达175.47%;随着蔗糖质量浓度的增大愈伤组织生长量的增量和增长率明显下降，分析原因可能是高质量浓度蔗糖引起了培养基高渗，影响细胞的生长。这与李毅［9］的蔗糖质量浓度大小与愈伤组织增长量成正比的结论不同。

各种植物激素质量浓度及配比对愈伤组织增殖及继代时的状态、褐化起一定的促进作用。王立强［10］报道，愈伤组织继代时高质量浓度生长素使组织松散极易褐化，继代后难以存活，甚至有时呈烂泥状;高质量浓度分裂素使愈伤组织结构致密，继代时不易褐化死亡。并发现组合KT0.5mg/L+2，4－D 0.5 mg/L继代苦豆子愈伤组织效果最好。本实验结果显示，不同植物激素质量浓度及配比对青钱柳愈伤组织的增殖有明显的差别。其中组合KT0.2 mg/L+2，4－D0.2 mg/L 效果最佳，平均增量和增长率都达到最高，且颜色鲜嫩，结构紧密呈颗粒状，适于继代培养。

稀土元素在植物组织培养领域已有广泛的应用。低质量浓度时可促进愈伤组织生长，高质量浓度时抑制生长，更高质量浓度时则使植物死亡，其作用与激素有许多相似之处［11］。鲁宽科［12］等以药用植物大黄的愈伤组织为研究对象，研究不同质量浓度的稀土元素Eu对愈伤组织生长的影响。结果发现，低质量浓度稀土元素Eu促进愈伤组织生长.高质量浓度则抑制生长。杜红梅等［13］报道，在培养基中添加1～100 mg/L La(NO3)3明显影响外植体的分化率、增殖倍数、幼苗的根数以及根系和茎叶中干物质的积累，其中1 mg/L La(NO3)3处理效果最佳;而高质量浓度(50～100 mg/L)La(NO3)3处理则显著降低了外植体的分化率和增殖倍数。本研究表明，培养基中添加适宜质量浓度(0.5 mg/L)的镧稀土后，愈伤组织的生长得到有效促进。但难度过高则对愈伤组织生长起抑制作用，可能是由于代谢物的积累增加，使愈伤组织褐化而抑制生长，有关机制尚待进一步研究。

［1］方升佐，洑香香.青钱柳资源培育与开发利用的研究进展［J］.南京林业大学学报:自然科学版，2007，31(1):95－100.

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