哮喘大鼠气道平滑肌细胞ERK信号通路调控Smad6/7的研究

卢虹蓓 张维溪 李昌崇

哮喘大鼠气道平滑肌细胞ERK信号通路调控Smad6/7的研究

卢虹蓓 张维溪 李昌崇

目的探讨在哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)中ERK信号通路对Smad6/7蛋白的调控。方法复制哮喘大鼠模型，原代培养ASMC，实验设未干预组(A组)、细胞外调节激酶(ERK)阻断剂(U0126)组(B组)、血小板源性生长因子(PDGF)组(C组)、PDGF+ERK阻断剂组(D组)。免疫组化法测定Smad6/7蛋白的表达，反转录－聚合酶链反应(RT－PCR)法测定Smad6/7 mRNA表达。结果哮喘大鼠ASMC中Smad 6/7蛋白B组显著高于A组(P＜0．01)，C组显著低于A组(P＜0．01)，D组与A组比较无统计学差异(P＞0．05);各组哮喘大鼠ASMC中Smad6/7 mRNA表达无统计学差异。结论哮喘大鼠ASMC中ERK信号通路调控Smad6/7的作用发生在蛋白水平，不发生于基因水平。

哮喘气道平滑肌细胞细胞外调节激酶Smad

我们通过体外培养哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)，血小板源性生长因子(PDGF)刺激哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖以及ERK特异性抑制剂U0126阻断ERK通路后，观察Smad6/7蛋白及其mRNA在哮喘大鼠气道平滑肌细胞内表达情况，探讨ERK信号通路对Smad6/7的影响。

材料与方法

1．主要试剂:DMEM培养基(法国Biowest公司)，胎牛血清(法国Biowest公司)，胰蛋白酶(法国Biowest公司)，大鼠IL－lβ双抗夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒(美国Biosouree公司)，大鼠抗小鼠α－actin单克隆抗体(武汉博士德公司)，兔抗大鼠Smad 6/7多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，重组大鼠PDGF－BB(美国R＆D公司)，U0126(美国Cell Singnal Technology公司)，Trizol(美国Invitrogen公司)，RT－PCR试剂盒(美国Fermentas公司)，Smad6/7和GAPDH引物(上海生工合成)序列如下:Smad6上游引物:5'－TGACTGCGAGACGGTGACTT－3'，Smad6下游引物:5'GGGACTCTACAGCCTCCAACAG－3'，产物242 bp;Smad7上游引物:5'－GACAAGGGAAGTGGATGGC－3'，Smad7下游引物:5'－TTAGCAGCAAGTAGTTTGAACG－3'，产物389bp;GAPDH上游引物:5'－CAAGTTCAACGGCACAGTCAA－3'，GAPDH下游引物:5'－TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC－3'，产物140bp。

2．实验动物:SPF级健康雄性SD(Sprague－Dawlay)大鼠24只，4～6周，体重120～160g。温州医学院动物实验中心提供。

3．哮喘动物模型的建立:复制我们既往已建立的哮喘大鼠模型，按随机数字表法取12只大鼠，第1天和第8天腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液1．5ml［内含OVA1mg和Al(OH)3100mg］［4，5］。激发阶段，第15天开始以1%OVA生理盐水溶液雾化吸入，隔天1次，每次30min，共60天，为哮喘大鼠，以备下一步哮喘大鼠ASMC培养所用。按随机数字表法另外12只为对照组，参照哮喘组方法，但致敏和激发时均以生理盐水代替OVA。各组均于末次激发后2h处死，留取血清并立即开胸，右肺经支气管肺泡灌洗留取BALF，切下左肺组织用于病理切片、免疫组织化学检测。

4．光镜及电镜观察:光镜下观察HE染色的肺组织中的支气管周围炎症细胞浸润和平滑肌增殖情况。每组各取1只大鼠，用H－600型透射电镜观察肺组织超微结构变化。

5．BALF中细胞分类计数:瑞氏－姬姆萨染色行白细胞分类计数。

6．支气管壁厚度(Wat)和气道平滑肌厚度(Wam)检测:挑选每只大鼠3～5支有完整横断面的中小支气管，应用Medlab生物信号采集系统(南京琅珈公司)采集图像，医学图像分析软件Image．pro plus 5.0测量肺内支气管基膜周径(Pbm)、支气管总面积(Wat1)、管腔面积(Wat2)，平滑肌外缘内气管面积(Wam1)，平滑肌内缘内气管面积(Wam2)，并用Pbm标准化，即分别以(Wat1－Wat2)/Pbm和(Wam1－Wam2)/Pbm来表示Wat和Wam。

7．ELISA法检测血清、BALF IL－1β含量:应用ELISA法测定血清和BALF中IL－1β浓度，测定方法按试剂说明书进行。

8．哮喘大鼠ASMC的培养和鉴定:取哮喘组已建立哮喘模型大鼠，以胶原酶－胰酶混合消化法培养哮喘大鼠ASMC，细胞生长融合后，用0．25%的胰蛋白酶消化，以107～108/L的密度传代培养，对细胞进行形态学观察并对细胞内平滑肌肌动蛋白α－actin进行免疫细胞化学染色，95%以上的细胞呈阳性着色，证实细胞为ASMC［8］。取生长状态良好的3～5代细胞用于实验。

9．哮喘大鼠ASMC的分组:取哮喘组已建立哮喘模型大鼠ASMC按加入药物及浓度的不同分为未干预组(A组)，加无血清DMEM 2ml;ERK阻断剂组(B组)，加含U0126的浓度10μmol/L的DMEM 2ml;PDGF组(C组)，加含PDGFBB浓度50μg/L的DMEM2ml;PDGF+ERK阻断剂组(D组)，加含PDGF－BB和U0126的浓度分别为50μg/L和10μmol/L的DMEM2ml。

10．哮喘大鼠ASMC的药物干预:细胞按6×103/cm2的密度接种于6孔板，待细胞长至接近融合时，吸出培养液，DHanks液洗细胞，加入含l%胎牛血清的DMEM/F12培养液，细胞饥饿24h，使细胞同步化于G0期，加入不同浓度的PDGF－BB和U0126，作用一定时间后，无血清培养基洗细胞，等待下一步实验。

11．免疫组化SP法检测细胞Smad6/7蛋白表达:哮喘大鼠ASMC内Smad 6/7蛋白的表达:从6孔板内取出爬有细胞的盖玻片，用SP法对细胞进行染色，胞质内棕黄色沉淀为阳性结果，应用image－pro plus图像分析软件测定阳性部位的平均吸光度(mean optical density，MOD)，用以代表阳性部位的蛋白表达水平。

12．RT－PCR法测ASMC内Smad6/7 mRNA的表达:提取哮喘大鼠ASMC总RNA，取1μl RNA样品加99μl DEPC处理的水中，混匀，采用紫外分光光度法测定OD260、OD280的值。RNA纯度以OD260/OD280的比值表示，要求比值在1．8～2.0之间。反转录反应体系体积为30μl，GAPDH和Smad同管扩增，每管加总RNA约1μg。RT－PCR反应条件为:42℃反转录60min，94℃预变性5min，然后92℃30s，58/60℃30s，72℃30s反应37个循环，72℃充分延伸8min，4℃终止反应。产物用2%琼脂糖电泳，用SmartView凝胶数字成像系统扫描分析扩增产物条带，Smad6/7 mRNA的相对含量用Smad6/7与GAPDH吸光度的比值表示。

13．统计学方法:用SPSS 10．0软件对数据进行分析:数据均以均数±标准差±s)表示，两组样本均数比较采用t检验;多组样本均数比较采用单因素方差分析(one－way ANOVA)，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结果

1．一般情况:哮喘组在激发时均出现不同程度的烦躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、大小便失禁等症状，严重者呼吸减慢或节律不齐，行动迟缓或俯伏不动，而对照组无上述表现。经过多次激发后，哮喘组上述症状反而有所减轻，但体重增长减慢，毛色无光泽。

2．病理改变:光镜下观察HE染色的哮喘大鼠肺组织中的支气管周围炎症细胞浸润和平滑肌增殖情况(图1～图3)。

3．BALF中白细胞分类计数:哮喘组嗜酸粒细胞百分比［(9．10±2．27)%］高于对照组［(0.91± 0.87)%，t=2.27，P＜0.01］。

4．哮喘大鼠与对照组平滑肌细胞厚度比较(μm2/μm±s):哮喘大鼠Wat检测结果(73．4± 5.6)高于对照组(35．7±1．7)(P＜0.01);哮喘大鼠Wam检测结果(38．9±4．2)高于对照组(14．5±1．1) (P＜0.01)。

6．ASMC内Smad6/7蛋白表达:哮喘大鼠ASMC中Smad 6/7蛋白B组显著高于A组(P＜0．01)，C组Smad 6/7蛋白显著低于A组(P＜0．01)，D组与A组比较无统计学差异(P＞0．05)(图4～图5、表1)。

7．ASMC内Smad6/7 mRNA的表达:各组哮喘大鼠ASMC内Smad6/7的表达无显著性差异(P＞0.05)(图6～图7、表2)。

表1 免疫组化检测各组哮喘大鼠气道平滑肌细胞Smad6/7蛋白表达(MOD±s)

表1 免疫组化检测各组哮喘大鼠气道平滑肌细胞Smad6/7蛋白表达(MOD±s)

与A组比较，★P＜0．01，△P＞0．05

组别重复次数平均吸光度(MOD) Smad6Smad7 A组100．41±0．020．56±0．05 B组100．69±0．05★0．78±0．03★C组100．23±0．04★0．34±0．05★D组100．43±0．03△0．53±0．02△F＜0．01＜0．01 206．3114．7 P

表2 各组ASMC Smad6/7 mRNA的表达

讨论

ERK信号转导通路广泛存在于多种细胞内，是MAPK信号通路的3个家族成员之一，已发现它在气道平滑肌上广泛分布，主要以ERK1、ERK2两种亚型存在［9］。ERK主要介导生长因子如:血小板源性生长因子(platelet－derived growth factor，PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor，bFGF)、胰岛素样生长因子(insulin－like growth factors，IGFs)等的细胞内信号转导，调节细胞的增殖、分化、迁移等生物学行为。I－Smad(Smad6和Smad7)蛋白是转化生长因子－β(TGF－β)细胞内信号转导的负调控蛋白，其功能是抑制受体激动的Smads蛋白介导的信号转导，阻断TGF－β介导的转录反应。研究发现Smad7较Smad6的抑制作用更为显著，Smad7由TGF－β诱导产生，是TGF－β信号转导途径的主要抑制性调控蛋白。Nakao等［10］免疫组化法观察发现哮喘组和正常组Smad7蛋白均主要表达于支气管上皮细胞，哮喘组较正常组低表达，Western blotting法检测亦显示正常组Smad7抗体较哮喘组高表达。哮喘患者支气管上皮细胞Smad7表达水平与基膜厚度及AHR呈负相关，Smad7抑制气道重塑部分通过抑制TGF－β介导的转录反应，支气管上皮细胞Smad7的表达调控与哮喘气道重塑和AHR密切相关。抑制TGF－β和BMP的信号转导的Smad6也是TGF超家族中骨形态发生蛋白信号的抑制因子，是TGF信号和BMP信号的负性调节交叉点，Smad6由BMPs诱导产生，其编码基因位于15q21～22染色体上。研究发现TGF－β超家族成员可以有效地诱导Smad6的mRNA的产生，Smad6可以通过自分泌负反馈环来控制TGF－β信号的强度和持续时间［11］。但其调节机制与Smad7不同，它不是作用于受体蛋白激酶，而是与Smad4竞争并结合被受体激活的R－Smad(如Smad1)，形成无活性的Smad聚合体，起到干扰该信号系统的转导的效目前Smad6作为I－Smad在哮喘气道重塑中的报道在国内外尚少。

本实验在哮喘大鼠ASMC中，用PDGF刺激致ASMC增殖，免疫组化法测得Smad6和Smad7蛋白表达减少;U0126阻断PDGF对ERK蛋白活化作用后，Smad6和Smad7蛋白表达却增加。本实验结果和上述研究结果以及本课题前期在动物模型中研究结果得出的结论基本一致:Smad6和Smad7蛋白是TGF－β细胞内信号转导的负调控蛋白，另外ERK通路可能对Smad通路在胞质内(蛋白水平)发生调节。

由于各实验的研究目的不同，研究对象、细胞类型以及所用的刺激因子也各不相同，因而对于ERK通路与TGF/Smad通路在细胞核内(基因水平)是否存在交联，目前尚无定论。在人肾小球系膜细胞中Ox－LDL能通过TGF－β/Smad信号通路促进纤溶酶原活化因子抑制剂－1(PAI－1)表达，TGF－β/ Smad信号通路激活ERK信号通路，ERK信号通路则与Smad2/3的激活有关。用ERK抑制剂PD98059或UO126处理后，则显著抑制了Ox－LDL介导的PAI－1 mRNA增加和Smad3的核表达以及蛋白复合物的形成，说明ERK活化后参与了Ox－LDL介导的Smad3核内激活。而Guo等［12］发现，在肾小球系膜细胞内，TGF－β促使Smad蛋白核转导以及Smad与SBE结合的效应不受ERK的调节。在成骨系MC3T3－E1细胞内，Ras－ERK通路不影响由TGF受体激活的Smad3的转录活性，提示ERK通路与TGF/ Smad通路在细胞核内也许不发生交互调节作用。Hong等研究了在人肾小球系膜细胞中氧化修饰低密度脂蛋白(Ox－LDL)介导的TGF－β信号通路和ERK激活的PAI－1转录呈正相关。本课题探讨哮喘大鼠ASMC中ERK信号通路对Smad6/7基因表达是否起调控作用。我们用RT－PCR技术检测了哮喘大鼠ASMC内Smad6/7 mRNA的表达，结果发现用PDGF激活ERK通路或用U0126阻断ERK通路后对Smad6/7 mRNA的表达没有影响。

总之，本研究发现在哮喘大鼠ASMC中ERK信号通路调控Smad6/7的作用发生在蛋白水平，不发生于基因水平。

1Zhang WX，Li CC．Airway remodeling:a potential therapeutic target in asthma［J］．World J Pediatr，2011，7(2):124－128

2Cokugras H，Akcakaya N，Seckin，et al．Ultrastructural examination of bronchial biopsy specimens from children with moderate asthma［J］．Thorax，2001，56(1):25－29

3Corbel M，Caulet－Maugendre S，Germain N，et al．Enhancement of gelatinase activity during development of subepithelial fibrosis in a murine model of asthma［J］．Clin Exp Allergy，2003，33(5):696－704

4管小俊，张维溪，李昌崇，等．细胞外信号调节激酶和转换生长因子β1在哮喘气道重塑中的作用以及糖皮质激素的调控［J］．中华医学杂志，2007，87(25):1767－1772

5李昌崇，管小俊，张维溪，等．细胞外信号调节激酶信号转导途径在哮喘大鼠气道重塑中作用及糖皮质激素的调控［J］．中华儿科杂志，2007，45(4):288－292

6Drummond AE，Dyson M，Le M，et al．Ovarian follicle populations of the rat express TGFβ signaling pathways［J］．Mol Cel Endocrinol，2003，202(1－2):53－57

7张维溪，戴欢，贺孝良，等．糖皮质激素调控哮喘大鼠气道重塑中TGF－β1/Smad信号通路的研究［J］．中国药理学通报，2009，(09):1142－1146

8卢虹蓓，张维溪，李昌崇．哮喘大鼠气道平滑肌细胞培养方法探讨［J］．温州医学院学报，2009，39(3):264－266

9Masuda T，Tanaka H，Komai M，et al．Mast cells play a partial role in allergen－induced subepithelial fibrosis in a murine model of allergic asthma［J］．Clin Exp Allergy，2003，33(5):705－713

10Nakao A，Sagara H，Setoguchi Y，et al．Expression of Smad7 in bronchial epithelial cells is inversely correlated to basement membrane thickness and airway hyperresponsiveness in patients with asthma［J］．J Allergy Clin Immunol，2002，110(6):873－878

11Whitman M．Signal transduction．feedback from inhibitory SMADs［J］．Nature，1997(389):549－551

12Guo B，Inoki K，Isono M，et al．MAPK/AP－1－dependent regulation of PAI－1 gene expression by TGF－beta in rat mesangial cells［J］．Kidney Int，2005，68(3):972－984

(收稿:2011－07－16)

(修回:2011－08－23)

Regulation of ERK Signal Pathway on Smad6/7 in Ariway Smooth Muscle Cells of Asthmatic Rats．

Lu Hongbei，Zhang Weixi，Li Changchong．Department of Respiratory Diseases，Affiliated Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical College，Zhejiang 325027，China

ObjectiveTo explore the effect of ERK signal pathway on Smad 6/7 in ariway smooth muscle cells(ASMC)of asthmatic rats．MethodsAsthmatic rats were copied．ASMC were cultured from asthmatic rats which were divided into four groups:control group (group A)，external signal regulated kinase(ERK)blocking agent(U0126)group(group B)，platelet－derived growth factor(PDGF) group(group C)，PDGF plus ERK blocking agent group(group D)．The protein expressions of Smad6/7 were detected by immunohistochemistry technique，and the mRNA expressions of Smad6/7 were detected by RT－PCR．ResultsThe expression of Smad6/7 protein in ASMC of group B was significantly higher than group A(P＜0．01)，and group C were significantly lower than group A(P＜0．01)．There were no significant difference between group D and group A(P＞0．05)．There were no difference in the mRNA expressions of Smad6/7 among all these groups(P＞0．05)．ConclusionThe regulatory role of ERK signal pathway on Smad6/7 in ASMC of asthmatic rats was on the level of protein，but not on the level of gene．

Asthma;Airway smoth muscle cells;External signal regulated kinase;Smad

气道重塑是支气管哮喘(简称哮喘)的特征性病理生理改变之一，是哮喘潜在的治疗靶点［1］。气道平滑肌细胞(ASMC)增殖在气道重塑中占有十分重要的地位，有报道显示哮喘病人气道平滑肌厚度是对照组的3倍［2］。当前，体外气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMC)培养是研究哮喘发病机制的重要手段。ERK信号转导通路广泛存在于多种细胞内，是MAPK信号通路的3个家族成员之一，已发现其在气道平滑肌上广泛分布，主要以ERK1、ERK2两种亚型存在［3］。我们既往的研究表明，ERK介导的信号转导途径在ASMC增殖中发挥着十分重要的作用［4，5］。Smads蛋白是TGF－β信号转导系统的重要成员，是TGF－β受体复合物的下游信号调节蛋白，参与调控细胞的增殖、转化、合成、分泌和凋亡［6］。TGF－β1被认为是哮喘气道重塑的主要调控因子，直接影响气道壁胶原沉积，促进纤维化的形成［7］。已知ERK通路和TGF－β/Smad通路在许多细胞中可发生对话，共同协调细胞的一些生物学行为，并且这两条通路都可促进ASMC的增殖，但这两条通路在哮喘发病中是否存在交互调节及它们之间发生交互调节的具体环节及分子机制目前还不清楚。

国家自然科学基金资助项目(30571981、30271383)

325027温州医学院附属育英儿童医院呼吸科(卢虹蓓、张维溪、李昌崇);丽水市中心医院儿科(卢虹蓓)

李昌崇，电子信箱:wzlichch@21cn．com