无菌塑料瓶无菌检验方法的验证

闫冰，宋新刚，李尊江

（哈药集团生物疫苗有限公司， 黑龙江哈尔滨 150069）

无菌塑料瓶无菌检验方法的验证

闫冰，宋新刚，李尊江

（哈药集团生物疫苗有限公司， 黑龙江哈尔滨 150069）

无菌塑料瓶是兽用灭活疫苗的主要内包装材料，灭活疫苗为非最终灭菌的产品，所以要求用于内包装材料的塑料瓶在使用前达到无菌。对无菌塑料瓶进行无菌检验，是保证产品质量的必要的条件。《中国兽药典》2005年版要求在对制品进行“无菌检验”及“微生物限度检验”时，应进行方法学验证，以确认试验中供试品应选择药典中所收载的何种供试液制备方法、保种测定方法，保证“无菌检查”或“微生物限度检查”方法的科学性和检验结果的准确性。

一、样品与仪器

1.样品。无菌塑料瓶，规格为100 ml/瓶，生产批号为091134。

2.试验用菌种。金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、铜绿假单胞菌（ATCC9027）、生孢梭菌（ATCC11437）、白色念珠菌（ATCC10231）、黑曲菌（ATCC16404）。所有菌株均来自中国兽药监察所。

3.稀释液。0.9%氯化钠溶液，经121℃30分钟高压灭菌。

4.培养基。硫乙醇酸盐液体培养基（50 ml/瓶）、葡萄糖蛋白胨培养基（50 ml/瓶），均为本公司自制，经无菌检验及培养基灵敏度试验合格。

5.仪器设备。薄膜过滤器6套，振荡仪、生化培养箱。

二、方法与结果

1.方法。

（1）取样量：每个过滤器取三支塑料瓶，分别加入标示量1/2的氯化钠无菌水溶液。

（2）每个过滤器取三支塑料瓶，分别加入标示量1/2的氯化钠无菌水溶液，轻轻振摇涮洗内壁，按薄膜过滤法过滤，取出滤膜分成两份，分别接种于硫乙醇酸盐液体培养基和葡萄糖蛋白胨培养基中培养，作为供试管。

（3）取3支无菌塑料瓶，分别加入50 ml的氯化钠溶液，轻轻振摇涮洗内壁，按薄膜过滤法过滤，在最后一瓶塑料瓶涮洗液中加入小于100CFU的金黄色葡萄球菌，过滤。取出滤膜，加入硫乙醇酸盐液体培养基中培养；作为试验管1。

（4）按上法操作，按薄膜过滤法过滤，在最后一瓶塑料瓶涮洗液中加入小于100CFU的铜绿假单胞菌，过滤。取出滤膜，加入硫乙醇酸盐液体培养基中培养；作为试验管2。

（5）按上法操作，按薄膜过滤法过滤，在最后一瓶塑料瓶涮洗液中加入小于100CFU的生孢梭菌，过滤。取出滤膜，加入硫乙醇酸盐液体培养基中培养；作为试验管3。

（6）按上法操作，按薄膜过滤法过滤，在最后一瓶塑料瓶涮洗液中加入小于100CFU的白色念珠菌，过滤。取出滤膜，加入葡萄糖蛋白胨培养基中培养；作为试验管4。

（7）按上法操作，按薄膜过滤法过滤，在最后一瓶塑料瓶涮洗液中加入小于100CFU的黑曲菌，过滤。取出滤膜，加入葡萄糖蛋白胨培养基中培养；作为试验管5。

（8）取硫乙醇酸盐液体培养基3瓶和葡萄糖蛋白胨培养基2瓶，分别加入以上小于100CFU的试验菌，培养，作为阳性对照管。

（9）取硫乙醇酸盐液体培养基和葡萄糖蛋白胨培养基各一瓶，作为阴性对照。

（10）以上各试验瓶均按规定温度培养3～5 d，观察试验菌的生长情况。

2.方法验证试验结果 （见表1）。试验管5管中的各试验菌均生长良好，显示塑料瓶采取的灭菌方法对无菌检查结果的判断没有影响，供试管各管在规定温度培养14 d逐日观察，供试品管均澄清，阳性对照管生长良好，判供试品符合规定。塑料瓶为产品内包材，本身无抑菌作用，通过方法确认塑料的灭菌方法对无菌检验结果的判断没有影响，故按实验方法建立的方法验试验，可作为无菌塑料瓶的无菌检查，但阳性试验菌只选择金葡萄球菌即可。

表1 方法验证试验结果

三、讨论

无菌塑料瓶在兽药生产领域使用非常广泛，建立无菌塑料瓶的无菌检验方法，是兽药产品质量的前提保证。薄膜过滤法作为无菌检查中的一种方法，具有准确、方便、快捷的优点，是无菌检查时所采用的一种重要方法，尤其对样品液体量较大的样本，更有其优越性，所以该无菌检查方法验证对保证结果的可信度和准确性具有重要意义。

（略）