牛甘露聚糖结合凝集素A基因糖基识别域生物信息学特征的研究*

李博文，李明涛，柏会文，刘玉芬

(哈尔滨师范大学)

0 引言

甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin，MBL)，是由肝细胞合成并分泌入血的一种天然免疫因子，属C型凝集素(Ca2+依赖型)超家族，被认为是非免疫宿主体内最重要的一线抗感染免疫分子［1］.MBL肽链有4个功能区域:一个富含半胱氨酸的N末端区、胶原样区(collagenlike region，CLR)、颈区和 C末端糖基识别域(carbohydrate-recognition domain，CRD).CRD是MBL的识别功能区，在Ca2+的参与下，CRD特异性地与多种细菌、病毒、恶性细胞表面具有的以甘露糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺、岩藻糖等糖类等为末端糖基的糖结构结合，通过CLR区而发挥效应［2］.牛MBL作为机体的一种天然免疫因子，在牛的天然防御过程中发挥着重要的作用，但是目前对于该因子结构的研究资料较少，本研究将对该分子的CRD区进行分析，为牛MBL-A的分子应用提供铺垫.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

新鲜牛肝脏组织

1.1.2 引物设计与合成

根据GenBank数据库中MBL-A的cDNA基因序列 (登录号:BC109674)，采用 Primer Premier 5软件设计一对特异引物，引物序列为正向引物5’-AGAAGCTGTATGTGACCAATCG-3’，反向引物5’-CAGAGCAGCAGGGAGACACT-3’，委托上海生工生物工程有限公司合成.

1.1.3 主要试剂与工具酶

AMV第一链cDNA合成试剂盒、UNIQ-10柱式胶回收试剂盒;TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、pMD18-T载体均购自上海生工生物工程有限公司.其它相关试剂均为国产分析纯.

1.2 方法

1.2.1 肝脏总RNA的提取

取牛新鲜肝脏组织0.5 g，用液氮迅速研磨成粉末状，加入 700μL SDS缓冲液，350μL Tris酚，350 μL 氯仿，100 μL β -巯基乙醇，用漩涡振荡器剧烈震荡 10 min，14000 rpm、4℃离心10 min.取上清，加入等体积酚∕氯仿，剧烈震荡5 min，14000rpm、4 ℃离心5 min，重复一次.取上清，加入等体积氯仿(氯仿∶异戊醇=24∶1)，剧烈震荡5 min，14000 rpm、4℃离心 5 min.取上清，加入等体积氯化锂∕无水乙醇(1∶1)，-20℃沉淀10 min，12000 rpm、4℃离心 15 min.再用适量DEPC水溶液(20～30μL)溶解，加入1/10体积β-巯基乙醇，溶解后电泳检测.

1.2.2 RT-PCR扩增牛MBL-A的CRD区

根据反转录试剂盒说明书提供的方法，将牛肝脏总RNA反转录成cDNA，进行PCR反应.建立10μL反应体系，依次分别加入 ddH2O 7.3 μL，10 ×Buffer 1.0μL，dNTP 2.0μL，cDNA 1.0 μL，Taq 酶0.1μL，上、下游引物各 0.4μL.扩增条件为94℃预变性5 min;94℃变性30 s，59℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，30个循环;72℃再延伸10 min.反应后电泳检测并进行结果判断.

1.2.3 目的基因片段与T-载体的连接

PCR产物经试剂盒纯化回收后，通过T/A克隆的方法，直接与pMD18-T载体连接，连接反应体系如下:纯化回收的PCR产物4.5 μL、Ligation SolutionⅠ5μl、pMD18-T Vector DNA 0.5μL，混匀后16 ℃连接过夜.

1.2.4 连接产物转化感受态细胞

取一管100 μL的DH5α感受态细胞，加入全部的连接产物10 μL混匀;置于冰上 30 min，42℃热休克1 min;加入1 mL LB培养液，37℃振荡培养大约1 h;将全部菌液进行无菌涂板，37℃过夜培养.

1.2.5 菌落PCR鉴定与菌种保存

以转化菌的单个克隆为模板，其余条件与1.2.2一致，鉴定和筛选阳性转化菌.选择5个阳性单菌落挑入同一平板中，37℃过夜培养;挑阳性单菌落于 LB培养基中，加入氨苄(100 μL∕100 mL)，37 ℃ 振荡培养过夜;取菌液700 μL 加入 1.5 mL eppendorf管，同时加入700μl、30%甘油，封口，-80℃保存.

1.2.6 牛MBL-A基因CRD区的序列测定

委托上海生工生物工程有限公司进行序列测定.

2 结果

2.1 牛肝脏组织总RNA的提取

经1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测后，呈现出两条清晰的条带(如图1).由上至下，第一条为28S的RNA，第二条为18S的RNA，两条带的亮度比为2∶1.该结果表明采用SDS法能够从动物的肝脏组织中提取出RNA，且完整性较好.

图1 肝脏组织中总RNA

2.2 牛MBL-A基因CRD区的扩增

经RT-PCR扩增，获得包括MBL-A基因CRD区的目的产物，引物跨度大约380 bp，电泳中显示清新的目的条带(如图2).

图2 MBL-A CRD的PCR扩增鉴定

2.3 阳性菌株的鉴定

菌落PCR将分离培养的菌体进行PCR扩增，得到特异性目的条带，证实为阳性阳性转化菌(如图3).

图3 菌落PCR扩增产物;M.DL2 000 M arker.其余均为MBL-A CRD的菌落PCR目的条带

2.4 牛MBL-A基因CRD区的序列测定

测序结果表明，MBL-A基因CRD编码区全长375bp，编码125个氨基酸残基.

3 讨论

该研究根据NCBI公布的MBL-A基因的全长cDNA序列，通过RT-PCR技术从牛肝脏总RNA中克隆出MBL-A基因的CRD片段，该片段长375 bp.CRD是MBL识别配体-糖结构的结构，既可以结合单糖成分(与之亲和性较差)又可以结合多糖成分(显示出高亲和性)［3］.结果表明，该片段含125个氨基酸残基，具有4个Cys残基和18个保守残基，这些氨基酸残基可以形成2个链内二硫键和2个Ca2+结合位点，使肽段折叠形成球形CRD，并以这种形式发挥其生理效应［4］.与Genbank上发表的其他一些参考物种的核苷酸和氨基酸序列相比，与参考物种MBL-A基因CRD的亲缘关系较近，与MBL-C较远［5］;与猪、恒河猴的亲缘关系非常近，与大鼠、小鼠亲缘关系较远，与禽类关系更远.

甘露聚糖结合凝集素作为天然免疫的重要组成部分，其功能的发挥主要依赖糖识别域.因此，研究MBL分子CRD的生物信息学特征，对进一步研究CRD的识别效应，进而阐明MBL介导的天然免疫防御功能具有重要意义;同时，本实验以牛MBL-A基因为研究对象，也为选育具有高抗病性的牛品种提供了理论依据.

［1］ Tabona P，Mellor A，Summerfield J A，et al.Mannose binding protein is involved in first-line host defence:evidence from transgen icm ice［J］.Immunology，1995，85(1):153.

［2］ Presanis J S，Kojima M，Sim R B.Biochemistry and genetics of mannan-binding lectin(MBL).Biochem Soc Trans，2003，31(4):748-752.

［3］ Kawasaki N，Kawasaki T，Yamashina I.Isolation and characterization of a mannan-binding protein from human serum.J Biochem(Tokyo)，1983，94(3):937-947.

［4］ Drickamer K.Ca2+-dependent sugar recognition by animal lectin.Biochem Soc Trans，1996，24(1):146-150.

［5］ Phatsara C，Jennen D G，Ponsuks I L I S，et al.Molecular genetic analysis of porcine mannose-binding lectin genes，MBL1 and MBL2，and their association with complement activity［J］.International Journal of Immunogenetics，2007，34:55-63.