DPD为底物评价Fe3O4纳米粒子分解H2O2的催化活性

王 宇

(“光电带隙材料”省部共建教育部重点实验室，哈尔滨师范大学)

0 引言

过氧化氢在环境化学和生物医学中是很重要的一种活性中间体，其浓度的检测在化学分析、环境分析及生物分析等领域都有着重要的研究意义［1］.目前，过氧化氢的检测方法有很多，例如，分光光度法［2-4］、荧光分析法［5］、电分析法［6］和化学发光法［7-8］等.

Bader于1988年提出了DPD法测量水中低浓度H2O2的研究结果［9］.与其他分光光度法相比，DPD方法精度高、所需测量仪器简单、检出限低，一经提出就得到了广泛应用［10］.基本原理是，如果溶液中有 H2O2存在，HRP催化氧化H2O2生成的产物会立即将DPD氧化成阳性离子基 DPD·+，DPD·+是一种粉红色的化合物，它有两个吸收峰，510 nm和551 nm处，通过测551 nm处的吸光度值，可计算溶液中H2O2浓度.

上述提到的DPD法是要依靠于HRP(过氧化物酶—辣根)的催化反应.但作为天然酶，HRP价格昂贵，不易长期保存，且容易失活.因此，寻找人工合成的类过氧化物酶引起了研究者的关注.

Fe3O4纳米粒子因特殊的理化性质，已在化学物质检测［11］、环境治理［12］、电传感器［13］等领域有着重要的应用价值.2007年，阎锡蕴课题组首次发现Fe3O4磁性纳米粒子具有类过氧化物酶的催化活性［14］.与HRP相比，Fe3O4磁性纳米粒子稳定性更具优势.因此，该文以 Fe3O4磁性纳米粒子替代 HRP，采用 DPD为底物，评价H2O2的分解程度，并检测过氧化氢的浓度.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

氯化亚铁(FeCl2·4H2O)、三氯化铁(FeCl3·6H2O)、氢氧化钠(NaOH)、过氧化氢(30%)、pH=6磷酸盐缓冲液和pH=4.5醋酸盐缓冲液(天津市科密欧化学试剂开发中心)，N，N-二乙基对苯二胺(DPD，上海源叶生物科技有限公司)，过氧化物酶—辣根(HRP，上海源叶生物科技有限公司).

紫外可见分光光度计(Lambda 45，美国Perkin Elmer公司);粉末X射线衍射仪(D8 Advance，德国布鲁克光谱仪器公司).

1.2 Fe3O4纳米粒子的制备

采用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子，制备温度分别为室温(RT)、60℃、100℃、140℃，经过高速离心、筛分［15］，标记为 CP-Fe3O4，将CP-Fe3O4粒子分散在蒸馏水中，并在140℃进行回流处理，得到 Fe3O4磁流体，标记为 FFFe3O4.

1.3 晶相结构分析

采用X射线衍射仪分析样品的晶相结构，测试条件:CuKα靶，电压40 kV，电流40 mA，扫描范围 20°-90°，样品的平均粒径根据 Sherrer公式计算.

1.4 对底物DPD的酶促动力学表观参数测定

取0.1 g DPD，溶于0.05 mol/L N H2SO4中，密封、避 光，5℃下保存.

取 5 mL 醋酸钠缓冲液(pH=4.5)，0.2 mL H2O2，加入10 mg Fe3O4纳米粒子，为得到线性回归方程，分别加入不同量 DPD(5 μL，10 μL，50 μL，0.1 mL，0.5 mL，1 mL)，搅拌，充分反应5 min后，磁分，取上清液，测551 nm处的紫外可见吸光度值，10 s后再测一次.两次测量差值，由计算即得到不同DPD浓度下对应的反应速度v.然后以DPD浓度的倒数为横坐标，以反应速度v的倒数为纵坐标作Lineweaver-Burk双倒数图，直线与x轴的截距为1/Km的绝对值，y轴的截距是1/vmax值［16］，Km米氏常数，属于酶的特征常数，此处代表Fe3O4纳米粒子与底物DPD亲和力的大小，Km值越小，表明Fe3O4纳米粒子与DPD的亲和力越高.

1.5 溶液中H2O2浓度的检测

取50 mL 蒸馏水，60 μL 30%H2O2，加入3 mL磷酸盐缓冲液(pH=6)，搅拌均匀，加入50 μL DPD，10 mg Fe3O4纳米粒子，搅拌 2 min，再将Fe3O4纳米粒子磁分，取上清液，在450～600 nm范围内测紫外可见连续光谱.根据551 nm处吸光度通过公式［H2O2］=，计算各样品中HO的分解量.其22中，A551为溶液在最大吸收波长(551 nm)处的吸光度，ε=21.000M-1·cm-1，l为比色皿的口径宽度，Vsample和Vfinal分别是测试样品的体积与所有试剂都加入样品后的总体积.空白对照组中不加Fe3O4纳米粒子.

2 结果与讨论

2.1 晶相结构分析

图1是Fe3O4粒子的XRD谱图.与标准的JCPDS卡进行对比，发现所有样品在30.10°，35.40°，43.40°，53.60°，57.30°及 62.80°均出现衍射峰，分别对应于 Fe3O4相的(220)，(311)，(400)，(422)，(511)和(440)晶面，说明所得产物均为Fe3O4.随着制备温度的升高，衍射峰的强度逐渐增强，而且相同制备温度下，FF-Fe3O4粒子的衍射峰强于CP-Fe3O4粒子.

图1 CP-Fe3O4粒子

表1 Fe3O4纳米粒子的平均粒径

表1显示，粒子的平均粒径随着制备温度的升高而减小，这可能是因为制备温度高，粒子的成核速度快，晶核的生长速度受到抑制，所得Fe3O4粒子的平均粒径就偏小［17］.相同制备温度下，FF-Fe3O4粒子的平均粒径小于CP-Fe3O4粒子，这说明 FF-Fe3O4粒子稳定性优于CPFe3O4粒子，不易团聚.

2.2 Fe3O4纳米粒子对底物DPD的酶促动力学表观参数

为比较Fe3O4粒子与HRP对检测H2O2所用底物DPD的亲和程度，测定了Fe3O4粒子对DPD的酶促动力学表观参数.图2是不同体系的Lineweaver-Burk双倒数图.

图2 不同温度下制备的CP-Fe3O4粒子

由Lineweaver-Burk双倒数作图得到的线性回归方程计算可知，在所有Fe3O4粒子中，只有室温、60℃下制备的CP-Fe3O4粒子与底物的亲和程度差于HRP，其余Fe3O4纳米粒子与检测H2O2浓度的底物都有很强的亲和力，而且相同制备温度下，FF-Fe3O4粒子与底物DPD的亲和力强于 CP-Fe3O4粒子.这表明，DPD适合作Fe3O4纳米粒子分解H2O2的分析底物，用于检测H2O2的浓度.

2.3 DPD为底物评价 Fe3O4纳米粒子分解H2O2的能力

图3是不同体系中的紫外可见吸光谱.各体系中H2O2分解量由551nm处吸光度值计算，见表2.

图3 DPD-H2O2体系中加入Fe3O4纳米粒子后的紫外可见连续光谱

表2 各样品中H2O2分解量 ×10-7mol/L

通过以上图表可得，体系中未加入Fe3O4纳米粒子时，H2O2与 DPD缓慢反应，生成少量DPD·+，曲线a的吸光度较低.当体系中加入CP-Fe3O4粒子和FF-Fe3O4粒子时，吸光度增大，且加入FF-Fe3O4粒子体系的吸光度大于加入CP-Fe3O4粒子的体系.这表明，Fe3O4纳米粒子能催化H2O2分解进而氧化DPD生成DPD·+，体系的吸光度增大.制备温度越高，Fe3O4纳米粒子催化分解H2O2的能力越强.对于相同制备温度下，FF-Fe3O4粒子催化分解H2O2的能力强于CP-Fe3O4粒子，这说明140℃蒸流水中的回流处理，促进了Fe3O4粒子分解H2O2的能力.这可能是由于经过140℃回流热处理后的Fe3O4表面羟基多，表面活性较强［18］，分解H2O2的能力也较强.结果也表明，所制备的Fe3O4粒子能够检测10-7mol/L的H2O2.

3 结论

采用共沉淀法，在不同温度下制备出CPFe3O4粒子和FF-Fe3O4粒子，CP-Fe3O4粒子和FF-Fe3O4粒子对DPD的亲和程度都很高，可以用DPD为分析底物评价Fe3O4粒子对H2O2的分解能力.不同温度下制备出的CP-Fe3O4粒子和FF-Fe3O4粒子都具有类过氧化物酶活性，可以催化H2O2分解，制备温度越高，Fe3O4纳米粒子平均粒径越小，粒子催化分解H2O2的能力越强，并且在相同制备温度下FF-Fe3O4粒子催化分解H2O2的能力强于CP-Fe3O4粒子，可以检测1×10-7mol/L的H2O2.

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