电针次髎穴对慢性膀胱过度活动症模型大鼠尿动力学及脊髓背角SP和CGRP影响

孙卫兵，杨 帆，齐清会

(1.大连医科大学附属第二医院泌尿外科，辽宁大连 116027;2.大连医科大学附属第一医院普外科，辽宁大连 116011)

电针次髎穴对慢性膀胱过度活动症模型大鼠尿动力学及脊髓背角SP和CGRP影响

孙卫兵1，杨 帆1，齐清会2

(1.大连医科大学附属第二医院泌尿外科，辽宁大连 116027;2.大连医科大学附属第一医院普外科，辽宁大连 116011)

［目的］探讨电针次髎穴对环磷酰胺(cyclophsphamide，CYP)致慢性膀胱过度活动症(overactive bladder，OAB)模型大鼠尿动力学及脊髓背角p物质(substance P，SP)和降钙素基因相关肽(calcitonin-gene related peptide，CGRP)的影响。［方法］雌性大鼠25只随机分为对照组5只，OAB模型组10只，OAB+电针(电针组)10只。其中模型组和电针组动物腹腔内注射环磷酰胺诱导OAB，应用膀胱测压技术动态观察电针次髎穴后排尿间期、基础膀胱压、膀胱最大充盈压及最大排尿压的变化;应用免疫组织化学方法定量观察电针后脊髓背角SP和CGRP表达变化。［结果］电针组和模型组的排尿间期与对照组相比明显缩短(P＜0.05)，基础膀胱压明显升高(P＜0.01)。电针后电针组的基础膀胱压较模型组明显降低(P＜0.01)，排尿间期较模型组明显延长(P＜0.01)。与对照组相比，模型组脊髓后角SP及CGRP表达明显升高(P＜0.05);与模型组相比，电针组的脊髓后角SP及CGRP表达降低(P＜0.05)。［结论］电针次髎穴能抑制环磷酰胺诱导的大鼠膀胱过度活动，降低脊髓后角SP和CGRP的表达，电针次髎穴治疗OAB可能与抑制膀胱传入神经的兴奋性及传入递质的释放与合成有关。

电针;膀胱过度活动症;P物质;降钙素基因相关肽;尿动力学

正常的膀胱感觉功能是维持人体周期性储尿和排尿的重要前提之一。近年研究表明，膀胱感觉功能异常在多种下尿路症状(low urinary tract symptoms，LUTS)的发生中起重要作用［1］。感觉增强会导致尿频、尿急、尿痛和急迫性尿失禁等储尿期症状，引起逼尿肌过度活动(detrusor overactivity，DO)，也是膀胱过度活动症(overactive bladder，OAB)主要发病机制之一。而传入性C纤维活动过度是逼尿肌反射亢进的关键病理机制［2］。

电针治疗OAB在临床上已被认可，本实验采用腹腔内注射环磷酰胺(CYP)诱导膀胱感觉异常的膀胱过度活动症大鼠模型，通过检测电针次髎穴前后大鼠尿动力学，L6脊髓背角P物质(substance P，SP)和降钙素基因相关肽(calcitonin-gene related peptide，CGRP)表达的变化探讨电针对膀胱储尿功能的影响及可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物及分组

健康、雌性、无孕史 SD大鼠25只，体重约在180～220 g，由大连医科大学动物实验中心提供，许可证号:SCXK(辽)2008-0002。将大鼠随机分成对照组(5只)，模型组(10只)和电针组(10只)，实验过程中对动物的处置符合国家颁布的有关善待实验动物的指导性意见要求。兔抗CGRP多克隆抗体(AB8056，abcam)兔抗 SP多克隆抗体(AB1566，CHEMICON INTERNATIONAL)。

1.2 膀胱过度活动模型的建立［6］

模型组及电针组小鼠腹腔内环磷酰胺诱导，建立膀胱过度活动模型。环磷酰胺的剂量为75 mg/kg，1次/3 d，共两周。对照组用相同容量的生理盐水注射，注射时间与模型组相同。

1.3 电针治疗方法

按照比较解剖和骨度分寸法为依据进行穴位定位。大鼠次髎穴(骶3孔)的定位:脊髓骶椎2、3节段旁开约0.5 cm处，不锈钢毫针以直插所选部位，进针约30～40 mm，接电针仪。刺激频率为20 Hz，连续波，针刺时间60 min。

1.4 尿动力学检查方法及检查指标

大鼠腹腔注射乌拉坦(1.0 g/kg)麻醉，大鼠尿道内插入F3导管，接三通管，其中一端接尿动力仪的膀胱压力传感器，体内置零;另一端接微量泵，以0.2 mL/min的速度向膀胱内灌注室温下生理盐水，至大鼠开始排尿时停止注水，连续测定3个排尿周期，测定排尿间隔时间、基础膀胱压、膀胱最大充盈压、最大排尿压。

1.5 分组检测

模型组:CYP诱导膀胱过度模型后行第1次尿动力学检测，连续测定3个排尿周期，1 h后重复进行第2次尿动力学检测。

电针组:CYP诱导膀胱过度模型后行第1次尿动力学检测，连续测定3个排尿周期，电针60 min后行第2次尿动力学检查。

对照组:尿动力学检测同模型组。

1.6 组织取材处理、观察指标及方法

组织取材:大鼠腹腔注射乌拉坦(1.0 g/kg)维持麻醉，迅速打开胸腔，立即左心室-主动脉插管，右心耳切开，20℃的生理盐水100 mL快速灌注冲洗后，再灌注室温的4%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS配制)400～500 mL约1 h，取L6-S1段的脊髓(长约1 cm)，置于4℃、4%多聚甲醛中外固定20 h，转入4℃、30%蔗糖溶液(0.1 mol/L PBS配制)过夜，待标本检测。

免疫组织化学程序:(1)冰冻切片，标本冰冻切片，厚度为20 μm，并且以每20取4片的方法取片;(2)脊髓后角切片采用免疫组化 ABC法行 SP、CGRP染色，依次加入一抗、二抗孵育，显色剂染色及复染、封片。

计算机图像分析:Imageproplus图像分析系统进行分析，每张切片观察3个视野，计算平均吸光度值。

1.7 统计学方法

计量资料表示为均数±标准差(±s)，采用SPSS16.0软件进行统计分析，组内比较采用配对t检验，组间比较Oneway ANOVA方差分析，运用GLM过程，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 治疗前后尿动力学参数变化

治疗前电针组和模型组的排尿间期与对照组相比明显缩短(P＜0.05)，基础膀胱压明显升高(P＜0.01)。治疗后电针组基础膀胱压较模型组明显降低(P＜0.01)，排尿间期较模型组明显延长(P＜0.01)，见表1。

表1 治疗前后尿动力学参数比较Tab 1 Compare urodynamic parameter before and after treatment (±s)

表1 治疗前后尿动力学参数比较Tab 1 Compare urodynamic parameter before and after treatment (±s)

1)与对照组相比，P ＜0.05;2)与对照组相比，P ＜0.01;3)与模型组相比，P ＜0.01

模型组(n=10) 电针组(n=10) 对照组(n=5)排尿间期(min)第 1 次 9.1 ±1.11) 9.7 ±1.51) 13.9 ±1.3第 2 次 10.2 ±1.6 13.2 ±1.13) 14.2 ±1.2基础膀胱压(cm H2O)第 1 次 15.2 ±2.22) 13.1 ±2.12) 8.9 ±1.4第 2 次 14.6 ±1.3 10.8 ±1.43) 9.4 ±1.3最大膀胱充盈压(cm H2O)第 1 次 23.4 ±3.3 22.3 ±2.6 18.3 ±1.7第 2 次 21.8 ±3.4 24.8 ±3.2 17.9 ±1.4最大排尿压(cm H2O)第 1 次 49.2 ±3.7 39.4 ±3.1 40.7 ±3.3第2次47.3 ±3.2 36.5 ±3.7 42.3 ±3.4

2.2 骶髓排尿中枢SP及CGRP表达变化

模型组骶髓排尿中枢SP及CGRP表达较对照组明显升高(P＜0.05);电针组的骶髓排尿中枢SP及CGRP表达比模型组降低(P＜0.05)，电针可以降低逼尿肌反射亢进大鼠骶髓排尿中枢 SP及CGRP 的表达，见表2，图 1、2。

表2 脊髓后角I、II层中SP、CGRP阳性纤维和终末平均光密度(A值)Tab 2 Mean optical density of SP，CGRP positive fibers in laminaeⅠ，Ⅱ in dorsal horn of sacral cord (±s)

表2 脊髓后角I、II层中SP、CGRP阳性纤维和终末平均光密度(A值)Tab 2 Mean optical density of SP，CGRP positive fibers in laminaeⅠ，Ⅱ in dorsal horn of sacral cord (±s)

1)与对照组相比，P ＜0.05;2)与模型组相比，P ＜0.05

SP CGRP模型组 1.16 ±0.191) 1.28 ±0.161)电针组 0.86 ±0.122) 0.92 ±0.092)对照组0.76 ±0.11 0.85 ±0.10

图1 大鼠脊髓背角P物质表达的影响Fig 1 Influence of electroacupuncture on expression of substance P in the dorsal horn of spinal cord

图2 大鼠脊髓背角CGRP表达的影响Fig 2 Influence of electroacupuncture on expression of CGRP in the dorsal horn of spinal cord

3 讨 论

DO是引起膀胱过度活动症的主要原因，目前对OAB的基础研究几乎完全以DO为基础来进行，且主要集中在逼尿肌方面的研究。抗胆碱药物治疗临床上未能取得满意的疗效，说明阻断传出神经抑制逼尿肌过度活动并不是解决OAB症状的唯一途径，因此目前许多学者开始研究膀胱传入神经的作用。

电针次髎穴治疗OAB临床上已取得较满意的疗效。次髎穴位于第2骶后孔，骶神经都从骶后孔通过，对次髎穴进行针刺加电刺激干预和骶神经调节有相似的作用。针刺治疗逼尿肌过度活动的作用机制目前尚不十分明确。动物实验显示:针刺通过抑制储尿期副交感排尿中枢的兴奋性，从而降低逼尿肌的紧张性收缩;也有学者研究证实:针刺能抑制膀胱传入神经的兴奋性来抑制逼尿肌过度活动［3-4］。然而这些逼尿肌活动亢进的动物模型中多为L-多巴诱发的模型，脊髓横断模型等。但上述模型均不是由膀胱病变引起传入神经功能异常有关的动物模型，不能直接证明电针具有降低传入神经兴奋性的作用。

动物实验中应用不同的化学浸润性物质可导致膀胱的过度活动，环磷酰胺是最常用的一种。腹腔内注射环磷酰胺可诱导大鼠膀胱产生出血性膀胱炎，通过C纤维引起膀胱的疼痛和刺激使排尿频率的增加，排尿膀胱容量的减少，最大排尿压力的减少以及膀胱基础压的增加，是与膀胱感觉异常有关的逼尿肌活动亢进的理想动物模型［5］。电针对这类动物模型排尿功能的影响尚未见文献报道。

本实验结果显示:与对照组相比，环磷酰胺诱导的膀胱过度活动症大鼠排尿频率增加，膀胱基础压明显增高。电针“次髎穴”60 min后排尿频率显著减少，膀胱压明显下降。电针次髎穴对环磷酰胺致大鼠逼尿肌活动亢进有明显的抑制作用。

近年来C类传入纤维作用在OAB的作用越来越受到关注。腹腔内注射环磷酰胺可诱导大鼠膀胱产生出血性膀胱炎，通过C纤维引起膀胱逼尿肌的过度活动。正常膀胱存在的感觉纤维主要分为Aδ类和C类，Aδ类为有髓鞘快传输纤维而C类传入纤维为无髓鞘的慢传输型神经纤维。膀胱的传入神经(健康脊髓)的兴奋主要由Aδ类纤维介导，Aδ纤维通过脊髓将信息传到脑干，然后传递至中脑水管周围的灰质，最后将膀胱充盈情况传递到脑桥排尿中枢Aδ纤维对膀胱的被动收缩和主动收缩都敏感。C类纤维其数量占膀胱传入纤维的60.0% ～70.0%，生理情况下只在膀胱高度充盈时C纤维才被激活。然而，这些纤维可被膀胱粘膜的化学性刺激或者冷刺激激活。在化学性刺激作用下，C纤维表现为膀胱空虚时自发放电，膀胱充盈时放电增强［7］。膀胱内注射辣椒素使C纤维脱敏，膀胱过度活动可被抑制，但是并没有抑制正常大鼠的排尿反射，这表明C纤维传入通路对正常排尿反射是非必须的［8］。有学者研究表明:电针骶部穴位能降低髓髓排尿中枢c-fos的表达，表明C纤维活动受到抑制，推测这可能是电针治疗逼尿肌反射亢进的机制之一［4］。

在脊髓中CGRP主要存在于小C纤维，Aδ类纤维的初级传入神经中，而外周伤害性刺激信息主要是由小C纤维，Aδ类纤维传递。大部分CGRP免疫反应阳性物神经分布于脊髓表层的两个脊髓背角。该部位也含有丰富的SP，其中一部分来源于脊髓背根感觉神经节的无髓C纤维，是伤害性初级传入末梢释放的一种兴奋性神经递质，存在于脊髓RexedⅠ层和II层的Aδ和C纤维上。外周性伤害刺激这些传热纤维可通过背角板层Ⅰ和Ⅱ的中间神经元相互作用，将神经肽递质SP背根神经节传送至脊髓背角，引起脊髓背角SP的释放。脊神经节细胞内合成后运输到感觉神经末梢，并在化学性刺激下或疼痛感觉时释放。CGRP与P物质(SP)共存于DRG的初级传入神经元中。CGRP可以抑制与SP降解有关的SP内肽酶，使SP的作用增加或延长。

目前有实验证实环磷酰胺诱导的膀胱炎膀胱传导通路中CGRP或SP表达上调。支配膀胱及尿道的背神经根神经节细胞体或突起中含有大量的神经肽类，PS和CGRP广泛分布在这些细胞中。环磷酰胺诱导慢性膀胱炎模型中CGRP和SP-IR在与排尿反射有关的脊髓节段和背神经根神经节(L6，S1)中增高。椎管内注射SP拮抗剂能减少膀胱逼尿肌过度活动，能增加清醒状态下大鼠的膀胱容量，排尿压无明显改变。CGRP和SP-IR膀胱传入神经细胞中枢和外周投射系统表达增加有助于这种过度活动的形成［9］。近年来研究醋酸西唑来汀，脊髓水平的CGRP和SP抑制剂，能明显抑制尿动力诊断逼尿肌过度活动病人尿急和尿失禁症状［10］。

本实验结果显示:模型组大鼠脊髓背角内SP、CGRP免疫阳性神经元均明显增加(P＜0.01)。电针60 min后大鼠膀胱内SP免疫阳性神经元较模型组明显减少(P＜0.01)。推测电针次髎穴有可能通过抑制 Aδ和 C类传入纤维投射所释放的 SP、CGRP，减少感觉信号的传递，从而抑制逼尿肌过度活动。

神经肽类表达的变化及在中央终端的释放导致控制排尿脊髓环路重建，这种重建包括以下几种变化:(1)脊髓排尿反射的突触组合;(2)特殊神经元单元的化学受体编码(初级传入神经元，中间神经元);(3)上行和下行脊髓反射投射组合方面。Aδ和C类传入纤维与脊髓背角伤害性感受神经元之间的突触传递不仅可以强化，也可以产生长时程的抑制制(long-term depression，LTD)。给外周传入纤维不同的条件刺激，在脊髓背角能产生不同的突触传递可塑性变化。如对Aδ传入神经纤维进行低频条件电刺激，在初级传入纤维与脊髓背角伤害性感受神经元之间形成的突触传递则诱发LTD，而对C纤维进行高频强直性条件电刺激则诱发LTD［11］;本实验采用高频电针治疗，其作用机制可能与抑制C纤维的突触传递抑制有关。

本研究结果提示，电针次髎穴可通过降低脊髓后角SP和CGRP的表达来抑制传入神经的兴奋性及传入递质的合成与释放、抑制C纤维的突触传递而影响脊髓排尿环路、抑制逼尿肌过度活动降低膀胱基础压及降低排间期等方式治疗OAB。

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Urodynamic effects of electroacupuncture at Ciliao on overactive bladder in rats and CGRP，SP expressions of dorsal horn of spinal cord

SUN Wei- bing1，YANG Fan1，QI Qing - hui2
(1.Department of Urology，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China;2.Department of General Surgery，the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116011，China)

Abstract:［Objectives］To investigate the urodynamic effects of electroacupuncture at CiLiao(BL 32)on overactive bladder(OAB)in rats induced by cyclophsphamide(CYP)and expressions of calcitonin-gene related peptide(CGRP)and SP in dorsal horn of spinal cord.［Methods］Twenty five Sprague-Dawley rats were randomly divided into:control group(n=5)，chronic OAB group(n=10)，chronic OAB+electroacupuncture group(n=10).OAB model was established by intraperitoneal injection(i.p.i)of cyclophsphamide，continuous cystometry was performed to detectinter- contraction interval，basal，threshold，micturition voiding pressure before and after electroacupuncture.The expressions of CGRP and SP in the dorsal horn of spinal cord were detected by immunohistochemical method.［Results］Compared with control group，inter-contraction interval was decreased(P＜0.05)and basal pressure was increased(P＜0.01)in both OAB and ele-ctroacupuncture group before acupuncture.While basal pressure was decreased and inter-contraction interval was increased significantly in acupuncture group compared with those in control group(P ＜0.01).Comparison with control group，the mean optical density(OD)value of SP and CGRP positive products in the dorsal horn of sacral cord in OAB group was increased significantly(P ＜0.05)，while compared with OAB group，the mean OD value of SP and CGRP in acupuncture group was decreased(P ＜0.05).［Conclusions］Electroacupuncture at CiLiao could inhibit the overactive bladder induced by cyclophsphamide in rats by decreasing the SP and CGRP expressions in the dorsal horn of spinal cord.

Key words:electroacupuncture;overactive bladder;substance P;calcitonin gene-elated peptide;urodynamic

R277.5

A

1671-7295(2012)03-0220-05

辽宁省自然科学基金资助项目(20082205)

2012-02-15;

2012-04-23

孙卫兵(1966-)，男，辽宁大连人，教授，主任医师。E-mail:massurm@163.com

齐清会，教授。E -mail:qiqh@medmail.com.cn