唐山地区食管癌患者癌组织中HPV16/18感染及p53基因多态性的检测

李向利 宋会新 张术波

1.河北省迁西县人民医院胸外科，河北迁西 064300；2.华北煤炭医学院附属医院，河北唐山 063000

食管癌是常见的十大恶性肿瘤之一，其发病率与地理区域、饮食习惯、遗传因素、和病毒感染等有关。其发生、发展涉及多因素、多步骤相互作用的复杂过程，且与多种基因的表达改变紧密相连[1]。故通过了解相关基因如何表达和调控机制，为探查食管癌的病因及治疗提供新的理论基础。近年来具有高致病性的人乳头状瘤病（HPV）16/18与食管癌的相关性备受学者的关注。笔者收集唐山地区食管癌患者资料，探讨HPV16/18感染和p53基因多态性与食管癌的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2005年5月～2010年11月在迁西县人民医院手术或胃镜活检共85例唐山地区食管疾病患者的新鲜食管组织标本，45例为食管癌患者，其中，男31例，女14例；年龄45～73岁，平均（56.7±5.8）岁；临床分期按照国际食管癌会议制定的标准分期为Ⅰ期25例，Ⅱ期15例，Ⅲ期5例；有淋巴结转移16例，无淋巴结转移29例。另外20例良性肿瘤，20例正常食管组织。所有病例均经术前快速冷冻病理和术后常规病理检查确诊，术前均行未化疗、放疗及免疫治疗。

1.2 方法

1.2.1 HPV16/18的检测 采用原位杂交试剂盒和生物素标记的高危HPV16/18 DNA探针，与蜡块切片做DNA原位杂交。切片于60℃～70℃烘烤60 min脱蜡，置入杂交增强液里，高火加热30 min，冷却后用蒸馏水洗涤，滴加杂交液后盖上盖玻片，置原位PCR仪95℃变性5 min后，转入含30%湿盒增效液的湿盒中，维持37℃过夜，磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡洗片，擦干后滴加内源性过氧化物酶阻断剂，37℃孵育30 min，PBS浸泡洗片，擦干后滴加动物非免疫血清，室温孵育20 min，PBS浸泡洗片，擦干后滴加DAB显色液，室温孵育10 min，PBS浸泡洗片，擦干后苏木素复染。常规封片，镜检。试验阳性对照:已知HPV16/18阳性的食管癌切片。

1.2.2 基因多态性分析 采用PCR-RFLP方法检测p53基因第4外显子72密码子多态性。先行引物设计，引物序列（5'→3'），正向引物 CAACACCATAGCAGTAGCAGC，反向引物CAGCCTCTCCTTCATACAGCC，按照试剂盒使用说明书对食管癌患者癌组织及其他标本提取DNA模板，而后行p53基因第四外显子PCR扩增，利用限制性内切酶对PCR扩增产物酶切后用2%的琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统中观察结果。

1.3 结果判断

HPV16/18原位杂交阳性信号为棕黄色颗粒，主要定位在细胞核和细胞质内。对肿瘤细胞的观察标准，阳性（+）:细胞核或质内见棕黄色颗粒，阴性（-）:细胞不着色。p53基因不同形态鉴定:仅在413 bp处显示条带的为Pro/Pro基因型，分别在253 bp和160 bp处出现条带的为Arg/Arg基因型，而在413 bp、253 bp、160 bp均有条带出现的为Pro/Arg基因型。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPVl6/18感染与食管癌患者不同部位组织中的表达情况

食管癌组织、良性肿瘤和正常组织中HPV16/18的感染情况45例食管癌组织中，HPV16/18阳性40例（88.9%），良性肿瘤中HPV16/18阳性2例（5.0%），正常组织中HPV阳性1例（2.5%），食管癌、良性肿瘤和正常组织中HPV16/18阳性率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 HPV16/18感染与食管癌患者不同部位组织中的表达情况

2.2 p53基因多态性在不同标本中的分布

食管癌、食管良性肿瘤和正常患者中三种基因型分布情况如下，在食管癌患者组织标本中各基因型分布频率分别为Pro/Pro基因型占20%，Arg/Arg基因型占42.2%，Pro/Agr基因型占37.8%；食管良性肿瘤组织标本中各基因型分布频率分别为Pro/Pro基因型占20%，Arg/Arg基因型占35%，Pro/Agr基因型占45%；在正常组织标本中各基因型分布频率分别为Pro/Pro基因型占20%，Arg/Arg基因型占20%，Pro/Agr基因型占60%。见表2。

表2 p53基因多态性在不同组别标本中的分布

2.3 p53基因多态性与HPV16/18感染的关系

在食管癌患者癌组织中，HPV16/18检测阳性者各基因型所占比例分别为纯合子Pro/Pro基因型17.8%，Arg/Arg基因型42.2%，杂合子Pro/Arg基因型40.0%，HPV16检测阴性者各基因型所占比例分别为Pro/Pro基因型37.5%，Arg/Arg基因型5.3%，Pro/Arg基因型5.6%；在患者癌组织中三种基因型构成比在HPV16/18感染组和未感染组差异经统计学分析有统计学意义（P<0.05）。而在食管良性肿瘤患者和正常对照组标本中，三种基因型构成比的差异均无统计学意义（P ＞ 0.05）。见表 3。

表3 p53基因多态性与HPV16/18感染的关系

3 讨论

全世界每年食管癌发病人数大于30万，其中一半在中国。其中环境因素、亚硝胺及营养因素为食管癌的主要病因因素，但其确切病因及发病机制仍未明了，因此展开了大量针对食管癌的分子生物学研究，其目的就是为了找出食管癌确切病因及发病机理，这为食管癌疾病临床的早发现、早诊断和早治疗起着决定性的作用[2]。近年研究发现HPV感染可能在食管上皮癌变中也起一定作用，并认为HPV感染下，可刺激或逐步引导并最终破坏原癌基因与抑癌基因之间相互依存、相互制约的平衡，致使细胞信号传导和细胞周期紊乱，使突变细胞出现异常增殖。目前p53基因已成为研究比较透彻的一种抑癌基因，一致认为其与细胞周期调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关。该基因的缺损或突变常常被证实与肿瘤的发生有关，自1998年首次报道p53第72密码子基因多态性与肿瘤的关系，有关p53多态性的研究越来越引起学者的兴趣[3]。HPV是小分子DNA病毒，目前已有一百余种分型，分为高危型和低危型两种，其中高危型主要是有恶变倾向，以HPV16/18为首，可导致p53丧失抑癌作用[4]。因此，发现早期诊断的特异性分子指标和手段已成为食管癌研究中的重要方向。

本研究显示食管癌组织、良性肿瘤和正常组织中HPV16/18的感染情况45例食管癌组织中，HPV16/18阳性40例（88.9%），良性肿瘤中HPV16/18阳性2例（5.0%），正常组织中HPV阳性1例（2.5%），在食管癌组织中的HPV16/18阳性表达明显高于良性肿瘤和正常食管组织，根据体外研究认为其编码的E6蛋白能与p53蛋白结合形成复合物，使其失去抑癌作用，促使细胞的增殖，相关研究显示HPV的感染存在地域性特征，并认为HPV的感染成为该地区食管癌高危因素，与本研究结果相一致[5]。HPV16/18高表达可促进正常细胞的恶变和食管癌细胞的增殖侵润，考虑野生型p53蛋白半衰期短，具不稳定性，不易检测，突变型P53蛋白其具有癌基因活性，可引起细胞恶性增殖且具有抗凋亡作用，导致细胞转化和肿瘤的发生，使检测成为可能，发生肿瘤时P53蛋白的大量表达均为突变型P53蛋白，其不再具有抑癌作用，而是促进细胞增殖。本研究显示p53基因第72密码子多态性在食管癌患者中Arg/Arg基因型占42.2%，明显高于良性肿瘤和正常食管组织中的35%和20%。在p53基因多态性与食管癌关系方面研究认为Arg/Arg纯合子基因型可能是食管癌的易感因素，与本文研究相同，但也有报道认为Por纯合子携带者将增加患食管癌的风险[6-7]。对于p53基因多态性与HPV16/18感染的关系，本研究认为HPV感染和Arg/Arg基因型有共存性。而在食管良性肿瘤患者和正常食管组织中则未见相关性。有相关研究认为癌组织中p53该位点的基因类型存在突变的可能，各个基因类型频率均不等，认为其与HPV16/18感染有关，与本实验结果相同。其发生的原因可能是由于HPV16/18感染后，产生并分泌的特殊蛋白E6具有与P53结合并促进P53突变与降解，使P53原有功能的丧失，但其通过何种机制产生该效果仍有待于进一步研究[8]。

综上所述，本文结果初步提示高危HPV感染与唐山的食管癌发生有关。联合检测食管癌中的HPV感染和Arg/Arg基因型的P53表达有助于评价食管癌的生物学行为。

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