镜检法在腹腔内接种包虫病动物模型中的应用

徐艺玫，刘 斌，史 深，燕顺生，廖力夫

(新疆实验动物研究中心，乌鲁木齐 830002)

镜检法在腹腔内接种包虫病动物模型中的应用

徐艺玫，刘 斌，史 深，燕顺生，廖力夫

(新疆实验动物研究中心，乌鲁木齐 830002)

目的 建立一种简单快速观察腹腔内接种包虫病动物模型的方法。方法 按2000个原头节/mL剂量，用多房棘球蚴对灰仓鼠进行腹腔接种，采用肉眼观察法和显微镜镜检法在第10天，15天，18天，22天，39天和60天观察灰仓鼠腹腔内包囊、包囊液和原头节的生长情况;设空白对照组10只。结果 通过肉眼观察和显微镜镜检，发现灰仓鼠在接种后的第18天有原头蚴生长;第15天，18天和22天包囊增大、增多;第39天有成熟原头节胚基生长;第60天有不同发育程度的原头蚴。随着接种时间的延长，包囊重量与传代时间成正比。结论 本试验为制备包虫病动物模型提供了简单快速的观察方法。

灰仓鼠;多房棘球蚴;原头节;诊断方法;模型，动物

包虫病又称棘球蚴病(echinococcosis)，是由棘球绦虫的幼虫寄生在人体内引起的自然疫源性人畜共患病。多房棘球蚴(Echinococcus muhilocularis E.m)系多房棘球绦虫的幼虫，是人兽共患多房棘球蚴病的病原体，具有外向增生包囊的特点，因此，被寄生的器官组织由于虫体不断外向增殖而遭受严重破坏，而且原头节还可经淋巴、血行转移扩散并移植;棘球蚴不仅压迫组织器官造成其严重的变形，而且由于包囊破裂，囊液导致再感染或过敏性疾病，给人造成严重的病症，甚至死亡。据估算我国有60～130万的棘球蚴病患者，仅新疆县级以上医院有记载的年包虫病手术病例最高年份约为2000例，以此推算，每年手术费用就高达 600万元［1］。包虫病给患者及其家庭带来极大的痛苦和沉重的经济负担［2］。在包虫病高流行地区，包虫病已成为制约当地经济发展、影响社会安定的公共卫生问题［3］。本研究通过包虫病动物模型镜检观察，建立动物模型的快速诊断方法，为探索包虫病动物模型的感染机制、病理改变、治疗效果评价等提供试验平台。

1 材料和方法

1.1 实验动物

2～3 月龄，清洁级灰仓鼠［4］，体重 35～45 g，共56只，雌雄各半来源于新疆实验动物研究中心【生产许可证 SCXK(新)2011－0001】，【使用许可证SYXK(新)2003－0003】。

1.2 实验设备和试剂

生物安全柜(BHC-1300IIA2)，显微镜，20目和40目不锈钢滤网，研钵，酒精灯，小型干燥器，医用棉花，双抗生理盐水(每毫升含青-链霉素各1000单位)、乙醚、酒精棉球、10%甲醛溶液、含氯消毒剂。

1.3 多房棘球蚴原头节的制备［5.6］

多房棘球蚴虫株采自新疆医科大学多房棘球蚴病病人的 E.m，在生物安全柜内无菌操作，对灰仓鼠采用腹腔接种的方法进行传代，饲养于IVC(独立通风系统)内。在生物安全柜内行安乐术处死传代接种5个月的灰仓鼠，使用固定解剖板，用酒精棉球擦拭颈部以下表皮和四肢，剖开灰仓鼠的腹部，取出包囊置于研钵内的20目滤网上，剪碎研磨，用双抗生理盐水冲洗两次，滤液经40目网过滤，用生理盐水从40目网的反方向冲洗下原头节，冲洗液自然沉淀后弃上清，沉淀的原头节用生理盐水清洗三遍，除去沉淀较慢的死亡和活力不好的原头节，制成原头节悬液。显微镜下观察混匀的原头节活动情况，用洋红染液排斥实验法检查原头节活力在80%以上，并计数调整，使原头节浓度为5000个原头节/毫升左右，4℃冰箱保存备用。

1.4 接种和实验方法［7］

按2000个原头节/只的剂量腹腔注射接种灰仓鼠，用1mL注射器，12号注射针头抽取摇匀的原头节悬液，每只0.4mL，共48只，对照组动物腹腔接种0.5mL生理盐水。分别于接种后的第10天，15天，18天，22天和39天行安乐术处死接种动物，对照组和60 d组同步处理，剖检动物，取其腹腔内的包囊，称量包囊和动物体重、肉眼观察、测量、计数和镜检。

1.5 包虫病动物模型的检测观察方法

肉眼观察包囊内是否有小白点，通过显微镜观察每组实验处理的包囊，观察包囊液内是否有原头节、包囊生成时间和原头节生成时间，包囊生长阶段，计算包囊系数(包囊重/体重×100%)，包囊浸泡于10%甲醛溶液中用于原头节观察、拍照、计算动物感染率、观察感染包囊发育状况。

2 结果

2.1 原头蚴接种动物的感染状况

腹腔接种48只，有效接种46只，感染43只。接种10 d组和60 d组各有一只动物分别于接种后的第2天和第3天死亡，解剖后未见腹腔内有包囊样结构，其它存活灰仓鼠随着接种时间的延长腹部逐渐增大，行动迟缓，精神萎靡;10d组中7只灰仓鼠有1只雄鼠剖检后没有发现包囊，感染率85.7%(6/7);15d组中2只雄鼠未发现包囊，感染率50%，4只雌性全部有包囊，雌性感染率高于雄性，总感染率 75%(6/8);18d、22d、39d和60d组雌雄灰仓鼠腹腔内均有E.m感染，感染率100%(表1)。空白对照组灰仓鼠同期于喂养60d内剖检，腹腔内未见囊泡样结构。

2.2 形态学观察［8］

解剖接种10 d组的7只动物，6只腹腔内有数量不多的包囊，包囊成透明空泡状，多为散在的小包囊，肉眼观察包囊内无白点，经40倍显微镜镜检观察无原头节生长(图1);解剖接种15 d组的8只动物，6只腹腔内有包囊，包囊数量较10 d组多，包囊成透明空泡状，散在的小包囊增多，肉眼观察包囊内无白点，经镜检观察无原头节生长(图2);解剖接种18 d组，8只灰仓鼠腹腔内都有包囊，包囊数量增多，包囊成大的透明空泡状，散在的小包囊增多，肉眼观察包囊内有白点(图3)，镜检观察有原头节生长(图7);解剖接种22 d组，8只灰仓鼠腹腔内包囊数量大而多，肉眼观察包囊内壁分布有许多小白点(图4)，镜检观察有原头节;接种39 d组的灰仓鼠，腹腔内有数量更多的大、小包囊，肉眼观察包囊内壁分布有许多小白点(图5，9)，几乎每个包囊都有原头节，镜检观察原头节数量随接种时间延长明显增多。60 d组后的灰仓鼠有不同发育程度的原头节生长(图6，10)。

2.3 包囊和原头节的生长情况［5;6;9］

从灰仓鼠体内取出包囊分别称重显示(表1)，随着接种周期的延长，包囊的重量和包囊系数成正比增长，原头节数量增多。根据不同的阶段观察多房棘球蚴在灰仓鼠腹腔的生长发育规律，对灰仓鼠感染10 d、15 d的包囊生长发育状态比较结果显示，有包囊生长，包囊囊重由0.97 mg增加至14 mg，囊重占体重比0.0131%～0.13%，显微镜镜检未发现原头节形成，第18天时，显微镜镜检有原头节出现;39 d后，肉眼观察灰仓鼠腹腔内有葡萄串样囊状物，有更多的包囊生长，呈乳白色、圆形、直径大小不等，包囊内壁分布有丰富的小白点;60 d后，包囊生长速度加快，有大量原头节自殖，使包囊外观囊泡状转变成团雾状，经显微镜观察有原头节生长，多至为100余个包囊，随着接种时间的延长，接种感染的包囊多附着于腹腔脏器表面或浆膜表面，包囊的大小及数量与包囊生长时间有一定的相关性。

表1 表1 包囊重量、数量和原头节数量的结果Tab.1 Results of the cyst weight，quantity，and the number of protoscoleces

3 讨论

理想动物模型的制备，是包虫病各项研究工作的基础。目前包虫病动物模型的效果评价多以包囊系数和病理切片结果作为判断标准，由于制备病理切片工作程序复杂，实验周期长，成本高，制备出的病理切片能在显微镜下观察到原头节的切片数不多，因此，需要探讨简单快速的方法评价包虫病动物模型的效果。

本研究通过对灰仓鼠感染多房棘球蚴病动物模型的建立，探索多房棘球蚴在灰仓鼠腹腔内各个发育阶段的生长规律，为寻求快速判断包虫病动物模型建立方法。应用多房棘球蚴接种灰仓鼠腹腔，分阶段观察、镜检，可在较短的实验周期内判断动物有无感染多房棘球蚴、在显微镜下观察包囊内是否有原头节生长、原头节在各个生长周期的发育情况等，这些都可以作为评判包虫病动物模型的指标。

通过外观肉眼观察有棘球蚴包囊生长、显微镜镜检发现有原头节生长，或许可以作为一个快速检测包虫病动物模型的方法，但更重要的是能及时观察到原头节的生长发育状况、感染效果和感染率，为建立灰仓鼠多房棘球蚴动物模型奠定有效的检测方法。

彩图如下［8］:

图1 接种多房棘球蚴虫株10天后，灰仓鼠腹腔内的包囊生长情况Fig.1 After multilocular echinococcus were intraperitoneally inoculated in the C.migratorus，observed the growth of intraperioneal cyst in the 10 days

图2 接种15天后腹腔内包囊生长情况Fig.2 After inoculating，observed the growth of intraperioneal cyst in the 15 days

图3 接种18天后腹腔内包囊生长情况Fig.3 After inoculating，observed the growth of intraperioneal cyst in the 18 days

图4 图4 接种22天后腹腔内包囊生长情况Fig.4 After inoculating，observed the growth of intraperioneal cyst in the 22 days

图5 图5 接种39天后腹腔内包囊生长情况Fig.5 After inoculating，observed the growth of intraperioneal cyst in the 39 days

图6 图6 接种60天后腹腔内包囊生长情况Fig.6 After inoculating，observed the growth of intraperioneal cyst in the 60 days

图7 显微镜观察接种18天后腹腔内包囊内原头节生长情况Fig.7 After inoculating，observed the growth of intraperioneal Protcoscolex with the microscope in the 18 days

图8 显微镜观察接种22天后腹腔内包囊内原头节生长情况Fig.8 After inoculating，observed the growth of intraperioneal Protcoscolex with the microscope in the 22 days

图9 显微镜观察接种39天后腹腔内包囊内原头节生长情况Fig.9 After inoculating，observed the growth of intraperioneal Protcoscolex with the microscope in the 39 days

图10 显微镜观察接种60天后腹腔内包囊内原头节生长情况Fig.10 After inoculating，observed the growth of intraperioneal Protcoscolex with the microscope in the 60 days

［1］谢增如，，温浩，等.骨细粒棘球蚴病动物模型的建立［J］.中国寄生虫病防治杂志，2005，18(2):127－128.

［2］由弘，张文宝，甫拉提，等.细粒棘球绦虫原发性感染动物模型的建立［J］.中国兽医寄生虫病，2003，l(2):9－12.

［3］张静，叶彬，邹晓毅，等.异源接种建立小鼠和兔包虫病动物模型的初步探讨［J］.第三军医大学学报，2011，33(7):679－681.

［4］廖力夫，黎唯，灰仓鼠的室内繁殖研究［J］.中国实验动物学报，1998，6(2):33－35.

［5］依斯拉因·乌斯曼，焦伟，廖力夫，等。灰仓鼠和子午沙鼠实验感染多房棘球蚴的比较观察［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1998，16(2):130－132.

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［8］余森海，许隆祺.《人体寄生虫学彩色图谱》［M］.中国科学技术出版社，1992年10月.

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Application of Microscopic Examination in Animal Models of Intraperitoneal Inoculating the Echinococcosis

XU Yi-mei，LIU Bin，SHI Shen，YAN Shun-sheng，LIAO Li-fu
(Xinjiang Laboratory Animal Research Center，Urumqi 830002，China)

Objective This study was designed to establish a simple and rapid methods for observing animal models of echinococcosis.Methods Multilocular echinococcus in a dose of 2000 protoscolex/mL were intraperitoneally inoculated in the C.migratorus.Using a simple visual observation and microscopic examination method，the growth of intraperioneal cyst，cyst fluid and protoscoleces was observed in the 10d，15d，18d，22d，39d and 60d after inoculation.Results Protoscoles were found in the 18d，and cysts became big and many in the 15d，18d and 22d.There was protoscoles blastemal growth in the 39d.Different degree of protoscolex was developed in the 60d.With the extension of the inoculation time，the cyst weight increased.Conclusion The methods for examination of animal models of echinococcosis were established.

C.migratorus;Cyst;Protcoscolex;Diagnostic method;Model animal

Q-95 R332

A

1671-7856(2012)09-0058-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.009.013

2012-08-28

国家“十一五”科技支撑计划重点项目(2009BAI83B02)。

徐艺玫(1973－)，女，副研究员，研究方向:动物实验与管理。E-mail:xymeimei@163.com。

廖力夫(1957－)，男，研究员，主要从事医学动物昆虫及应用研究。