中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉小鼠免疫功能调节作用的比较

傅惠英，张利棕，寿旗扬，周卫民，屠 珏，陈民利

(1.浙江中医药大学第二临床医学院，杭州 310053;2.浙江中医药大学动物实验研究中心，杭州 310053)

中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉小鼠免疫功能调节作用的比较

傅惠英1，张利棕2，寿旗扬2，周卫民2，屠 珏2，陈民利2

(1.浙江中医药大学第二临床医学院，杭州 310053;2.浙江中医药大学动物实验研究中心，杭州 310053)

目的 观察中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠免疫功能的影响。方法 分别给予中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉后，测定观察对小鼠碳粒廓清功能、迟发性变态反应、溶血素抗体、淋巴细胞增殖和NK细胞活性等的影响。结果 3.0 g/kg中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉可显著提高小鼠吞噬指数和半数溶血值(P＜0.01)、显著提高T、B淋巴细胞增殖能力(P＜0.01，P＜0.05)、显著提高NK细胞活性(P＜0.05)，0.5～1.5 g/kg中国被毛孢都能显著抑制小鼠耳廓肿胀(P＜0.01，P＜0.05)，同时还能抑制脾脏和胸腺增大(P＜0.01，P＜0.05)。结论 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉均具有免疫调节作用，而中国被毛孢免疫抑制及增强天然免疫系统作用要优于蝙蝠蛾拟青霉，而对适应性免疫系统增强作用蝙蝠蛾拟青霉优于中国被毛孢。

中国被毛孢;蝙蝠蛾拟青霉;小鼠;免疫功能调节

冬虫夏草(Cordyceps sinensis)是我国传统滋补中药材，但由于价格的昂贵及野生资源的枯竭，人们逐渐使用人工虫草菌粉来替代天然冬虫夏草。从上个世纪80年代起，我国研究人员陆续从天然冬虫夏草中分离到多个菌种，文献报道已有22个学名，涉及13个属［1］。随着分子生物学手段发展，越来越多的证据显示中国被毛孢为冬虫夏草的无性型［2～4］。但杨金玲等［5］发现冬虫夏草除了中国被毛孢菌寄生外，还存在着蝙蝠蛾拟青霉等内寄生菌，进而认为冬虫夏草功效可能归因于中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉及其它内寄生菌的不同代谢产物共同作用。因此，本文以天然冬虫夏草作对照，分别观察中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠免疫功能的影响，比较两者在调节免疫功能方面的差异，为临床使用提供依据。

1 材料

1.1 药物和试剂

1.1.1 药物:中国被毛孢(Hirsutella sinensis，HS)，黄色粉末;蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali，PH)，黄色粉末，均由杭州泰士生物科技有限公司提供。冬虫夏草(Cordyceps sinensis，CS):产地青海玉树，购自青海药材公司，打粉并60目过筛。以上三种药物避光干燥、常温(25℃以下)保存，临用前用生理盐水溶解至所需浓度。

1.1.2 印度墨汁(080321，北京中西远大);碳酸钠(051109，上海虹光化工厂);二硝基氟苯(20081011，上海化学试剂公司);都氏试剂(031114，宁波慈城生化);刀豆素(20071001，sigma);脂多糖(024K4067，sigma);噻唑蓝溶液(27196EJ，sigma);二甲基亚砜(20060607，无锡海硕生物);YAC－1细胞(中科院上海细胞所);绵羊红细胞悬液(绵羊外颈静脉取血，除去纤维蛋白，加入10倍量的保存液);补体(取5只豚鼠全血，分离出血清，将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4℃冰箱30 min，离心取上清，－70℃保存)。

1.1.2 动物:SPF级 ICR小鼠，体重 18～22 g，雄性，210只，SPF级 BALB/c小鼠，体重 18～22 g，雄性，36只，由中国科学院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司提供［生产许可证:SCXK(沪)2007－0005］。

1.1.3 仪器设备:半自动生化分析仪，荷兰 Merck Vitalab Micro;FA1004型分析天平，上海天平仪器厂;TG－16型高速冷冻离心机，上海安亭科技仪器公司;725型－86℃低温冰箱，美国 FORMA;128C－340型酶标仪:奥地利 CliniBio;CB－150型 CO2培养箱:德国Binder;ZEISS AXIOVERT 200倒置显微镜:德国ZEISS。

1.2 方法［6-8］

1.2.1 对小鼠体内碳粒廓清功能影响:取体重为18～22 g的雄性ICR小鼠70只，按体重随机分为7组，即正常对照组、模型对照组、HS低剂组(1.0 g/kgHS)、HS高剂组(3.0 g/kg HS)、PH 低剂组(1.0 g/kg PH)、PH高剂组(3.0 g/kg PH)和 CS组(1.0 g/kg CS)，每组10只，连续灌胃给药7 d，每日一次。末次给药24 h后，除正常对照组尾静脉注射生理盐水，其余各组小鼠尾静脉注射稀释4倍的印度墨汁(0.1mL/10g体重)，注入墨汁后 2、10 min，分别从内眦静脉丛取血10 uL，并立即将其加到1mL 0.1%Na2CO3溶液中。在600 nm波长处测OD值。取小鼠肝脏和脾脏，吸干脏器表面血污后称重。计算吞噬指数 =(体重/肝脾重)×［(logOD2－logOD10)/(T10－t2)］1/3。

1.2.2 对二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应影响:取体重为18～22 g的雄性ICR小鼠70只，按体重随机分为7组，即正常对照组、模型对照组、HS低剂组(0.5 g/kg HS)、HS高剂组(1.5 g/kg HS)、PH低剂组(0.5 g/kg PH)、PH高剂组(1.5 g/kg PH)和CS组(0.5 g/kg CS)，每组10只，连续灌胃给药13 d，每日一次，给药第7天时致敏，小鼠腹部皮肤用脱毛(3cm×3cm)，用1%DNFB溶液50 μL均匀涂抹致敏。致敏5 d后，用 DNFB溶液10 μL均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击，攻击后24 h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳廓。用打孔器取下直径8mm的耳片，用分析天平精密称重，并计算耳肿胀度，取脾脏和胸腺，称重计算脾脏和胸腺指数。

1.2.3 对SRBC致小鼠溶血素抗体生成影响:取体重为18～22 g的雄性ICR小鼠70只，按体重随机分为7组，即正常对照组、模型对照组、HS低剂组(1.0 g/kg HS)、HS高剂组(3.0 g/kg HS)、PH 低剂组(1.0 g/kg PH)、PH高剂组(3.0 g/kg PH)和 CS组(1.0 g/kg CS)，每组10只，各组分别给予相应浓度的相应药物，每日一次，连续给药7 d，腹腔注射20%SRBC0.2mL免疫4 d后，小鼠眼眶取血，取血清用SA缓冲液稀释500倍。将稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10%(v/v)SRBC 0.5mL，补体1mL(用SA液按1∶8稀释)。另设不加血清的对照管(以SA液代替)。置37℃恒温水浴中保温30 min后，冰浴终止反应。2000 r/min离心10 min。取上清液1mL，加都氏试剂 3mL，同时取 10%(v/v)SRBC 0.25mL加都氏试剂至4mL，充分混匀，放置10 min，于540 nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值，计算样品管半数溶血值(HC50)，HC50=(样品的吸光度值/SRBC半数溶血时的吸光度值)×稀释倍数。

1.2.4 对小鼠脾淋巴细胞增殖反应和NK细胞活性影响:取体重为18～22 g的雄性BALB/c小鼠36只，按体重随机分为6组，即空白对照组、HS低剂组(1.0 g/kg HS)、HS高剂组(3.0 g/kg HS)、PH 低剂组(1.0 g/kg PH)、PH高剂组(3.0 g/kg PH)和 CS组(1.0 g/kg CS)，每组6只，连续给药7 d后，进行脾淋巴细胞增殖反应和NK细胞活性测定。

1.2.4.1 脾淋巴细胞增殖反应:小鼠无菌取脾于培养基中，捣碎，使细胞分散均匀，过滤，离心，去上清，培养液洗涤2次。脾细胞制成10×106个/mL，布板:96孔板每孔加细胞200 μL，每一样重复4孔，同时设立空白对照。样品孔加 ConA2.5 μg/mL或LPS5.0 μg/mL，对照孔不加，37℃ 5%CO2培养箱中培养 72 h。加入 MTT 10 μL，继续培养 4 h，弃上清液，加入二甲基亚砜 150 μL，充分振荡，于 570 nm测OD值。计算刺激指数:刺激指数 =加 ConA或LPS细胞孔的平均OD值÷对照孔的平均OD值。

1.2.4.2 NK细胞活性检测:取 YAC－1靶细胞和效应细胞各100 μL(效靶比50∶1)，加入96孔培养板中;靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100 μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各100 μL;设三个复孔，于 37℃、5%CO2培养箱中培养4 h，然后将96孔培养板以1500 r/min离心5 min，每孔吸取上清100 μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100 μL，反应3 min，每孔加入1 mol/L的HCl 30μL，在酶标仪490 nm处测定光密度值(OD)。NK细胞活性(NK cell activity，%)=(ODT－(ODS－ODE))/ODT×100%，ODT:靶细胞空白光密度值，ODS:样品光密度值，ODE:效应细胞空白光密度值。

2 结果

2.1 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠体内碳粒廓清功能影响

由表1可见，与模型对照组比较，给予3.0 g/kg中国被毛孢、3.0 g/kg蝙蝠蛾拟青霉和1.0 g/kg冬虫夏草后，小鼠碳粒吞噬指数均显著升高(P＜0.05);而1.0 g/kg中国被毛孢和1.0 g/kg蝙蝠蛾拟青霉有升高小鼠碳粒吞噬指数的趋势，但无显著差异(P＞0.05)。

表1 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠体内碳粒廓清功能影响(±s，n=10)Tab.1 The effects in carbon clearance function by HS and PH in mice(±s，n=10)

表1 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠体内碳粒廓清功能影响(±s，n=10)Tab.1 The effects in carbon clearance function by HS and PH in mice(±s，n=10)

注:与正常对照组比较，ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01;与模型对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01Note:compared withnormal control group，ΔP ＜ 0.05，ΔΔP ＜0.01;compared with model control group，*P ＜ 0.05，＊＊P＜0.01

组别/Groups给药剂量/Drugs吞噬指数/Phagocytic index正常对照组 NS20mL/kg 0.680±0.864模型对照组 NS20mL/kg 3.650±0.257△△HS低剂组 1.0g/kg 3.831±0.318 HS高剂组 3.0 g/kg 3.941±0.213*PH低剂组 1.0 g/kg 3.836±0.405 PH高剂组 3.0 g/kg 3.959±0.229*CS组 1.0g/kg 3.977±0.330*

2.2 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应影响

由表2可见，与正常对照组比较，模型对照组小鼠经二硝基氟苯(DNFB)诱导后，耳廓明显肿胀和脾脏显著增大(P＜0.01)，胸腺略有增大，但无显著性差异(P＞0.05)。给予不同剂量的中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉后均具有不同程度的抑制小鼠耳廓肿胀、脾脏增大，与模型对照组比较，1.5 g/kg中国被毛孢的小鼠耳廓肿胀显著降低(P＜0.01)，0.5 g/kg中国被毛孢、0.5－1.5 g/kg蝙蝠蛾拟青霉和0.5 g/kg冬虫夏草对小鼠耳廓肿胀度均明显降低(P＜0.05);1.5 g/kg中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和0.5 g/kg冬虫夏草能明显抑制脾脏增大的作用(P＜0.05)，1.5 g/kg中国被毛孢高和0.5 g/kg冬虫夏草能显著抑制胸腺增大的作用(P＜0.01，P＜0.05)。

表2 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对DNFB诱导小鼠迟发型变态反应影响(±s，n=10)Tab.2The effects in DNFB－induced delayed type hypersensitivity by HS and PH in mice(±s，n=10)

表2 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对DNFB诱导小鼠迟发型变态反应影响(±s，n=10)Tab.2The effects in DNFB－induced delayed type hypersensitivity by HS and PH in mice(±s，n=10)

注:与正常对照组比较，ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01;与模型对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01Note:compared with normal control group，ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜ 0.01;compared with model control group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

组别/Groups 给药剂量/Drugs dose 耳肿胀度/Ear swelling(mg)胸腺系数/Thymus index(mg/10 g)正常对照组 NS10mL/kg 0.47±3.50 37.74±7.32 20.65±2.31模型对照组 NS10mL/kg 28.83±8.37△△ 57.52±9.76△△ 22.04±4.25 HS低剂组 0.5g/kg 20.94±3.59* 50.28±6.04 21.05±3.11 HS高剂组 1.5 g/kg 19.30±4.57＊＊ 46.55±4.69* 17.01±2.37＊＊PH低剂组 0.5 g/kg 21.11±5.77* 51.80±8.34 19.23±5.94 PH高剂组 1.5 g/kg 20.03±6.03* 47.23±11.27* 19.30±5.32 CS组 0.5 g/kg 20.78±5.22* 49.41±4.09* 18.03±2.91脾脏系数/Spleen index(mg/10 g)*

2.3 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对SRBC致小鼠溶血素抗体生成影响

由表3可见，与正常对照组比较，模型对照组的小鼠半数溶血值明显升高(P＜0.01);与模型对照组比较，3.0 g/kg中国被毛孢、1～3.0 g/kg蝙蝠蛾拟青霉和1.0 g/kg冬虫夏草均能显著升高小鼠的半数溶血值(P＜0.01)，1.0 g/kg中国被毛孢对SRBC免疫小鼠的半数溶血值有明显升高作用(P＜0.05)。

表3 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对SRBC致小鼠溶血素抗体生成影响(±s，n=10)Tab.3 The effects in SRBC－induced hemolysin antibody by HS and PH in mice(±s，n=10)

表3 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对SRBC致小鼠溶血素抗体生成影响(±s，n=10)Tab.3 The effects in SRBC－induced hemolysin antibody by HS and PH in mice(±s，n=10)

注:与正常对照组比较，ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01;与模型对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.Note:compared with normal control group，ΔP ＜ 0.05，ΔΔP ＜0.01;compared with model control group，*P ＜ 0.05，＊＊P＜0.01.

组别/Groups 给药剂量/Drugs dose 半数溶血值/HC50正常对照组 NS20mL·kg－1 53.06±1.44模型对照组 NS20mL·kg－1 309.74 ±38.76△△HS低剂组 1.0 g·kg－1 341.94±29.26*HS 高剂组 3.0 g·kg－1 355.69 ±26.87＊＊PH 低剂组 1.0 g·kg－1 354.84 ±28.66＊＊PH 高剂组 3.0 g·kg－1 363.88 ±14.70＊＊CS 组 1.0 g·kg－1 350.60 ±13.80＊＊

2.4 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠脾淋巴细胞增殖反应和NK细胞活性影响

由表4可见，与空白对照组比较，中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉高剂量(3.0 g/kg)组和拟青霉低(1.0 g/kg)剂量、冬虫夏草组均能显著提高T淋巴细胞增殖作用(P＜0.01)，中国被毛孢低剂量组也能显著提高T淋巴细胞增殖作用(P＜0.05)，但作用明显低于拟青霉低剂组(P＜0.05);中国被毛孢、拟青霉、冬虫夏草低剂量组还能促进B淋巴细胞增殖作用，而中国被毛孢低剂量组无显著作用。与正常对照组比较，被毛孢高剂量组(3.0 g/kg)和低剂量(1.0 g/kg)以及冬虫夏草组均能显著性提高NK细胞活性(P＜0.05)，被毛孢低剂量(1.0 g/kg)提高NK细胞活性的作用明显强于蝙蝠蛾拟青霉低剂量(1.0 g/kg)，蝙蝠蛾拟青霉无论高、低剂量组对NK细胞活性均无显著性差异。

表4 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠脾淋巴细胞增殖反应和NK细胞活性影响(±s，n=6)Tab.4The effects in Splenocyte proliferation and NK cell activity by HS and PH in mice(±s，n=6)

表4 中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠脾淋巴细胞增殖反应和NK细胞活性影响(±s，n=6)Tab.4The effects in Splenocyte proliferation and NK cell activity by HS and PH in mice(±s，n=6)

注:与空白对照组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与 HS低剂组比较，aP＜0.05Note:compared withblank control group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;compared with model control group，aP ＜0.05

组别/Groups 给药剂量/Drugs dose T淋巴细胞SI值/T lymphocytes SI value NK细胞活性/NK cell activity(%)空白对照组 NS20mL/kg 2.355±0.372 1.546±0.309 21.09±4.51 HS低剂组 HS1.0g/kg 2.785±0.404* 1.726±0.184 27.38±4.81*HS高剂组 3.0 g/kg 3.135±0.390＊＊ 1.827±0.136* 27.63±4.88*PH 低剂组 1.0 g/kg1 3.438±0.513＊＊a 1.805±0.135* 21.38±2.44aPH高剂组 3.0 g/kg 3.638±0.824＊＊ 1.906±0.253* 23.54±4.30 CS组 1.0 g/kg 3.311±0.416＊＊ 1.801±0.126* 26.94±5.24 B淋巴细胞SI值/B lymphocytes SI value*

3 讨论

中国被毛孢菌粉和蝙蝠蛾拟青酶已有很多文献报道均有免疫调节功能，其增强或抑制作用取决于机体的生理状态，即炎症迹象的程度，在无炎症迹象时，冬虫夏草促进DCs向Th1型免疫，反过来，就抑制Th1型超敏反应，在一定程度上体现了中医药对机体调控作用的特色［9］。本文通过免疫药效功能评价体系对中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉一同进行免疫调节作用研究，观察两者是否具有差异。

实验结果显示，中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉和冬虫夏草均具有免疫调节作用，但两者在作用程强和作用靶向性各有倾向。在免疫增强方面，中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉均可显著提高小鼠吞噬指数和半数溶血值;同时也均能促进 T、B淋巴细胞增殖能力，但蝙蝠蛾拟青霉作用要强于中国被毛孢;中国被毛孢还能显著提高NK细胞活性，而蝙蝠蛾拟青霉在本研究中未发现。在免疫抑制方面，中国被毛孢除能抑制小鼠耳廓肿胀程度外，还能抑制小鼠脾脏和胸腺增大，而蝙蝠蛾拟青酶对胸腺增大无作用，中国被毛孢免疫抑制作用要强于蝙蝠蛾拟青霉。

因此，通过检测中国被毛孢菌粉和蝙蝠蛾拟青霉菌粉对先天性免疫系统NK活性、吞噬指数的影响及对适应性免疫系统细胞免疫、体液免疫的影响，结果表明中国被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉均具有免疫调节作用，但中国被毛孢免疫抑制作用及增强天然免疫系统作用要强于蝙蝠蛾拟青霉，而对适应性性免疫系统增强作用蝙蝠蛾拟青霉略强于中国被毛孢。

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［2］赵锦，王宁，陈月琴等.冬虫夏草无性型的分子鉴别.中山大学学报(自然科学版)1999.38(1):121.

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［4］魏鑫丽，印象初，郭英兰等.冬虫夏草及其相关类群的分子系统学分析.菌物学报.2006，25(2):192.

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［7］王辉，林琳，陈民利，等.盐酸奥芬米洛对小鼠细胞免疫功能的影响［J］.实验动物与比较医学，2008，28(3):177.

［8］寿旗扬，傅惠英，陈方明，等.中国被毛孢发酵物对NOD小鼠1型糖尿病的预防作用［J］.中草药.2010，41(8):1311－1315.

［9］Li CY，Chiang CS，TsaimL，et al.Two－sided effect of Cordyceps sinensis on dendritic cells in different physiological stages［J］.Journal of Leukocyte Biology.2009，85(6):987－995.

Comparison and Characterization on Immunomodulatory Function of Hirsutella sinensis and Paecilomyces hepiali in Mice

FU Hui－ying1，ZHANG Li－zong2，SHOU Qi－yang2，ZHOU Wei－min2，TU Jue2，CHEN Min－li2
(1.The Second Clinical Medical College，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China;2.Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medical University.Hangzhou 310053，China)

Objective Compare with the immunomodulatory function by Hirsutella sinensis and Paecilomyces hepiali in vivo.Method After the mice were administrated by Hirsutella sinensis and Paecilomyces hepiali.Observed carbon particle clearance function，delayed type hypersensitivity，hemolytic antibody，lymphocyte proliferation and NK cell activity in mice，and Cordyceps sinensis as a positive control.Result 3.0g/kg Hirsutella sinensis and Paecilomyces hepiali can significantly improve the phagocyte index and half of hemolysis value(P＜0.01).3.0 g/kg Hirsutella sinensis and Paecilomyces hepiali can significantly improve the T，B lymphocyte proliferation(P＜0.01，P＜0.05).3.0 g/kg Hirsutella sinensis can significantly enhance the activity of NK cells(P＜0.05).0.5～1.5 g/kg Hirsutella sinensis can significantly inhibit the ear edema in mice(P＜0.01，P＜0.05)，at the same time 1.5 g/kg Hirsutella sinensis can inhibit the spleen and thymus increases(P＜0.01，P＜0.05).Conclusion Hirsutella sinensis and Paecilomyces hepiali have Immunomodulatory effects.Hirsutella sinensis.The Hirsutella sinensis were better than Paecilomyces hepiali in immunosuppression and enhance the role of the innate immune system.Paecilomyces hepiali were better than the Hirsutellasinensis in enhanced adaptive immune system.

Hirsutella sinensis;Paecilomyces hepiali;Mice;Immunomodulatory function.

R285.5 R332

A

1671－7856(2012)09－0016－05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.009.004

2012－08－25

浙江省自然科学基金项目(Y2110727);浙江省中医药科学研究基金计划(2011ZA021)。

傅惠英(1980－)，女，研究方向:中药药理学，E－mail:fhy131@126.com。

寿旗扬(1979－)，男，研究方向:中药药理与比较医学，E－mail:sqy133@126.com。