不同品种实验兔虹膜酪氨酸酶基因序列和表达量的变化

朱 亮，蔡月琴，屠 珏，陈民利

(浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究中心，杭州 310053)

不同品种实验兔虹膜酪氨酸酶基因序列和表达量的变化

朱 亮，蔡月琴，屠 珏，陈民利

(浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究中心，杭州 310053)

目的 从酪氨酸酶基因序列和表达量两个方面探讨酪氨酸酶与家兔虹膜颜色表型的关系。方法通过PCR扩增和测序检测4个具有不同颜色性状的家兔品种的酪氨酸酶基因外显子序列多态性;通过荧光定量PCR检测酪氨酸酶基因表达水平。结果 白化品种日本大耳白兔和獭兔的TYR基因序列在第1118个碱基处都由C突变为A，并导致编码蛋白在373位，即最后一个N－糖基化位点发生由Thr到Lys的突变。白毛黑眼兔和青紫兰兔在第870个碱基处全部发生由A到T的无义突变。在白毛黑眼兔种群的所有个体和獭兔种群的部分个体中都发现TYR基因序列在第91个碱基处发生G到A的突变，导致氨基酸序列第31位处Val到Met的变异。经内参基因GAPDH的校正，TYR基因在白毛黑眼兔和青紫兰兔中表达水平显著高于在日本大耳白兔和獭兔中的表达水平(P＜0.01)。而在白毛黑眼兔和青紫兰兔之间、日本大耳白兔和獭兔之间，TYR基因的表达差异没有显著性。结论 家兔TYR基因突变可能大幅度降低TYR基因表达，导致酪氨酸酶功能低下，从而影响虹膜颜色表型。

酪氨酸酶;虹膜;白毛黑眼兔;日本大耳白兔;獭兔;青紫兰兔;

酪氨酸酶是黑色素产生过程中的关键酶。该蛋白主要在黑素细胞中表达，而黑素细胞主要分布在哺乳动物皮肤和眼睛的色素细胞层中。针对人类和小鼠的研究显示，酪氨酸酶基因的突变可以导致眼皮肤白化病(oculocutaneous albinism，OCA)，累及眼部组织和皮肤组织［1］。

哺乳动物虹膜颜色一直被认为与色素细胞层中黑色素的分布数量和种类有关。酪氨酸酶是黑色素产生过程中的关键酶。黑色素生物合成过程大体可分为两个阶段，第一阶段是由酪氨酸酶催化酪氨酸被羟化反应形成 L－3，4－二羟基丙氨酸(L－多巴)，并进一步将 L－多巴氧化生成多巴醌(DOPA quinon)。这两步反应都是由酪氨酸酶催化的，酪氨酸酶在这里显示了独特的双重催化功能。第二阶段以多巴醌为原料从两个不同途径分别生成两种不同类型的黑色素(真黑素和褐黑素)［2］。

哺乳动物的酪氨酸酶基因编码序列全长1.6 Kb，包括5个外显子。对于酪氨酸酶基因影响表型的方式目前存在不同的观点。一些研究提示基因序列的突变导致了表型的变异。如针对人类和小鼠的研究显示，酪氨酸酶基因的突变可以导致从完全白化到部分有色的一系列色素沉积相关性状变化［3，4］。但 Nakamura 等［5］用酪氨酸酶基因内的微卫星标记来进行虹鳟鱼的显性白化病连锁分析，结果显示两者无关联，表明显性白化病与酪氨酸酶基因的突变无关。而另一些研究者认为黑色素细胞里酪氨酸酶基因表达量与色素沉淀性状有密切的关系。Commo等［6］研究发现 TYR在色素沉着性毛发中的基因表达量明显高于非色素沉着性毛发中，并提出色素沉着性毛发的黑色素细胞里TYR基因表达量高的部分原因是由于酪氨酸酶活性增强。Pomerantz 与 Iwata 等［7，8］研究发现酪氨酸酶在黑种人皮肤中的活性高于在白种人皮肤中的活性。

日本大耳白兔是我国常见的实验用兔，表型呈现出完全白化，被毛白色，虹膜无色素沉淀。白毛黑眼兔是来自日本大耳白兔种群的突变个体经十四年保种培育而建立的一个新实验兔封闭群。因为其全身被毛白色而眼部虹膜为黑色，经鉴定命名其为日本大耳兔黑眼系，简称白毛黑眼兔。这两种实验兔遗传背景接近，变异性状明显，是研究家兔虹膜颜色变异遗传原理的良好材料。为了增加研究结果的说服力，本研究另外选取了獭兔和青紫兰兔两种具有极端相反虹膜颜色的家兔品种作为辅助证据。獭兔也是一种具白化表型的家兔，而青紫蓝兔被毛蓝灰色、耳尖及尾面黑色，眼圈、尾底及腹部白色，腹毛基部淡灰色，眼部虹膜为深蓝色。

本研究选取以上4种不同虹膜颜色表型的家兔品种，从酪氨酸酶基因(TYR)序列、酪氨酸酶基因表达量这两个方面探讨酪氨酸酶与家兔虹膜颜色表型的关系。

1 材料和方法

1.1 实验动物

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA的提取:取家兔耳部皮肤，用酚氯仿法抽提DNA。DNA经过乙醇梯度沉淀后溶于TE缓冲液，－20℃储藏备用。

1.2.2 RNA的提取和反转录:处死家兔后取眼部虹膜组织。立即使用 Takara(大连)的 RNAiso Plus提取试剂盒提取RNA。提取过程按照说明书操作。获得的 RNA加入 DNase I(TaKaRa，大连)，37℃水浴20 min处理去除基因组DNA。取纯化过的RNA 1 μL稀释后用多功能酶标仪(Thermo)测定A260和A280值，确定其浓度和质量。

提取获得的RNA立即进行反转录。反转录使用TaKaRa(大连)PrimeScrip反转录试剂盒。操作按试剂盒说明书进行。反转录获得的cDNA置于4℃保存。

1.2.3 TYR基因编码区的扩增:编码序列的扩增分成两部分进行:(1)从基因组 DNA中扩增一个0.95 kb的片段，其中包含 TYR基因第一外显子。上游引物位于启动子区域(5＇－TAGGACTTAGCC AAACATGTG－3＇;翻译序列开始前第 85个核苷酸处)，下游引物位于第一内含子的5＇端 (5＇－TCTCACAGTCTATGTCCAGTAC－3＇;外显子结束后的第7个核苷酸处);(2)其余的外显子从cDNA中扩增，片段长度约1.0 kb。上游引物位于第一外显子 3＇端(5＇－GAAATCCAGAAGCTGACAGG－3＇)，下游引物位于TYR翻译终止子之后第77个核苷酸处(5＇－CATAGATACCAGTCTATTGGGC－3＇)。退火温度55℃ (Bio－Rad PTC－200)。扩增产物送上海生工测序。

测序获得序列使用DNAstar软件包中的EditSeq软件进行拼接，即获得完整的TYR基因编码区序列。使用 DNAstar软件包中的 MegAlign软件进行序列比对。

本研究参考的家兔野生型TYR基因序列来自于德国巨型兔(German giant)(Gen Bank序列号AF210660)，是 Bernhard 等［9］2000 年首先测序获得的。

1.2.4 荧光定量PCR检测:利用 Primer premier 5.0引物设计软件，根据已知家兔酪氨酸酶基因序列(GenBank序列号 AF210660)设计引物。由TaKaRa(大连)工程有限公司合成。引物序列为(5＇－3＇): F－CAGCATCTTTCTTCTCCTCTTGG; RAGTCCTGGCTTTGTCATGGTTT。退火温度55℃(Bio－Rad IQ5)。全部循环结束后作溶解曲线检测引物质量。

1.2.5 标准曲线的建立:将cDNA模板10倍等比稀释7次，将一共8个梯度浓度的样品分别用TYR和GAPDH引物进行实时荧光检测，每个稀释样品重复3次。将得到的CT值对初始模板量的log值做标准曲线。并计算R2值(可信度，显示实验数据的线性程度)。

通过对不同立体林下油用牡丹栽培模式的研究表明，油用牡丹-香椿套种模式牡丹的生长生理状况最佳，定植第4年(林下套种3年)油用牡丹产籽量达191.36 kg/667m2，比油用牡丹单一种植模式增产51.97%，而油用牡丹-碧桃套种和油用牡丹-核桃套种模式则分别比油用牡丹单一种植模式减产58%和94%。因此，综合立体栽培模式下油用牡丹的生长指标及产量表现，初步认为油用牡丹-香椿套种模式在河南地区具有较大推广价值。

2 结果

2.1 TYR基因编码序列多态性

各品种家兔TYR基因核苷酸序列多态位点如图1所示。白化品种日本大耳白兔和獭兔的TYR基因序列在第1118个碱基处都由C突变为A，并导致编码蛋白在373位，即最后一个N－糖基化位点发生由Thr到Lys的突变。该位点在所有参与检测的实验兔个体均表现为纯合。

白毛黑眼兔和青紫兰兔在第870个碱基处全部发生由A到T的无义突变。在12个白毛黑眼兔个体中有5个显示杂合状态，在12个青紫兰兔个体中则有7个显示杂合。在白毛黑眼兔种群的所有个体和獭兔种群的部分个体中都发现TYR基因序列在第91个碱基处发生G到A的突变，导致氨基酸序列第31位处Val到Met的变异。另外，多品种共享的编码序列错义突变在本研究检测的个体中未出现。

2.2 TYR基因mRNA表达检测结果

家兔目标基因TYR和内参基因GAPDH的溶解曲线见图2，图中的峰型单一且稳定，说明本研究使用的引物设计合理。

图1 不同品种家兔TYR基因核苷酸多态位点测序图a.第1118碱基位点;b.第870碱基位点;c.第91碱基位点Fig.1 The rabbit strains examined showing sequence variability.a.The 1118th neocleotide;b.The 870th neocleotide;c.The 91st neocleotide.

图2 内参基因GAPDH(左)和目标基因TYR(右)的溶解曲线图。Fig.2 Dissociation curve for TYR(left)and GAPDH gene(right).

对经等比稀释的样品进行荧光定量PCR，根据所获CT值做图，得到TYR和GAPDH两对引物的标准曲线。其中TYR标准曲线斜率为3.375，R2值为0.998;GAPDH标准曲线斜率为 3.068，R2值为0.991。利用公式(E为扩增效率，P为标准曲线斜率)计算得到TYR和GAPDH两对引物的扩增效率分别为97.8%和111.8%。

家兔TYR基因在不同家兔品种中的相对表达量见图3。经内参基因GAPDH的校正，TYR基因在白毛黑眼兔和青紫兰兔中表达水平及显著高于在日本大耳白兔和獭兔中的表达水平(P＜0.01)。而在白毛黑眼兔和青紫兰兔之间、日本大耳白兔和獭兔之间，TYR基因的表达水平差异没有显著性。

图3 TYR基因在日本大耳白兔、獭兔、白毛黑眼兔和青紫兰兔中的相对表达量。Fig.3 Relative expression level of TYR gene in Japanese White，Rex，WHBE and Chinchilla rabbits.

3 讨论

3.1 TYR基因编码序列多态性

迄今为止，文献报道的TYR基因突变方式已达217种，包括错义突变、无义突变、移码突变、剪切位点突变等［10］。错义突变主要集中于下列5个区域:铜离子结合位点(CuA和 CuB)，N末端至 CuA间，CuB至N末端疏水跨膜区域间，以及2个铜离子结合位点之间的区域。而无义突变、移码突变等则相对随机的分布于TYR基因的编码区域各部分。不同的突变方式对同一基因功能的影响有所不同。一般认为，无义突变和移码突变可导致特定的多肽产物缺乏和功能丧失，生物学效应明显;而错义突变能产生复杂的效应。因此，TYR基因的无义突变和移码突变会导致酪氨酸酶无表达或低表达，继而破坏黑色素的形成。而错义突变影响酪氨酸酶的催化基团形成，酪氨酸酶可以形成但是功能缺失。

现有的实验兔种群都是以封闭群形式饲养管理的。不同的毛色和眼色是实验兔鉴定和分类的主要特征。酪氨酸酶作为色素生成的关键酶，编码序列中多态性往往会造成的动物个体表型的差异，从而在选育过程中被误认为种间差异而人为分开。因此，与行使其他功能的基因位点相比，酪氨酸酶在特定品种中总是显示出较低的杂和度。

本研究检测所得的品种特有序列突变位点都为纯合型，而且编码区没有出现非品种特异性突变。这一现象再一次支持了TYR基因表达形式的假说，即TYR基因编码区的错义突变是以隐性形式行使功能的。

本研究检测的两个完全白化实验兔品种(日本大耳白兔和獭兔)都出现了相同的突变(T373 K)，导致该基因编码的酪氨酸酶的最后一个 N－糖基化位点发生了变异。有研究表明人类基因中同一位点的突变会导致 I型白化病［4］。由此推论，家兔酪氨酸酶基因第1118碱基位点的突变与家兔虹膜色素沉着表型相关。

白毛黑眼兔来自于日本大耳白兔种群中的突变个体，突变个体由白毛红眼变成白毛黑眼。如果以德国巨兔为野生型对照的话，白毛黑眼兔在373氨基酸位点上发生了回复突变，同时表型也由虹膜色素缺失导致的红眼回到了跟野生型个体相似的黑眼。这一现象提示我们，TYR基因1118碱基处由C到A的突变很可能会影响酪氨酸酶的功能，从而影响黑色素的合成和分布过程。而同时我们也观察到，白毛黑眼兔在373氨基酸位点上发生变异后，虹膜组织产生了色素沉着，但并没有改变动物个体的被毛颜色。以上现象提示毛色和虹膜颜色的基因控制可能是有部分重叠的两条不同通路。白毛黑眼兔个体中另存在某些突变与色素形成过程的上游步骤相关，能够影响皮肤黑色素的发生、转移或者行使功能，但不影响虹膜组织。

3.2 TYR基因mRNA表达

目前，进行基因表达相对定量分析普遍采用的计算方法为2－ΔΔCt法，该方法利用目的组基因和对照组基因相对于内参基因的定量，获得目的组基因相对于对照组基因的表达变化倍数。该方法因为其简单、经济、高通量而被广泛用于相对定量研究。但是使用该方法有个前提条件，即目标基因和内参基因扩增效率都接近于100%且相互间效率偏差在5%以内。而实际研究中，受引物和样本的限制，许多基因的扩增效率在反复调整后也无法达到100%。因此，本研究在定量分析中采用了 Pfaffl法［11］。该方法在 2－ΔΔCT法的基础上做了修正，将目标基因和内参基因的扩增效率分别带入计算，最终获得目的组基因和对照组基因的表达变化倍数。用此方法得到的结果因为考虑了目标基因和内参基因的扩增效率差异，得到的结果比2－ΔΔCT法更精确。需要指出的是，利用 Pfaffl法对扩增效率的要求虽然没有2－ΔΔCT法那么严格，但并非对扩增效率完全没有限制，扩增方程的斜率要求在3.0～3.5之间为宜。R2值显示实验数据满足衰减的线性程度，用来衡量重复样品数据是否一致和不同拷贝数的初始模板是否具有相同的扩增效率。如果重复样品的CT值明显不同，R2值会变低。这时就应该优化反应条件，保证定量PCR反应的R2值 ＞0.980。

本研究目标基因和内参基因的引物扩增效率在经过调整后分别为97.8%和111.8%，标准曲线斜率分别为 3.07和 3.38，R2值分别为 0.991和0.998。以上数据结合溶解曲线说明:本研究中荧光定量检测选用的引物和扩增条件理想，后续分析结果可靠。

酪氨酸酶作为黑色素生物合成过程中的限速酶，能够催化黑色素生物合成过程中的前两步反应，即催化酪氨酸羟化为左旋多巴和左旋多巴氧化为多巴醌的反应［2］。

由于酪氨酸酶的重要性，编码酪氨酸酶的TYR基因也就成了研究黑色素性状和虹膜颜色形成的候选基因之一。本研究发现TYR基因在虹膜呈深色的白毛黑眼兔和青紫兰兔中的mRNA表达量是虹膜无色素沉积的实验兔品种的3.54～4.31倍，差异显著。

值得注意的是在本研究涉及的两个完全白化家兔品种中，酪氨酸酶依然存在较低量的表达，与之相对应的现象是这两个品种的家兔个体仍保有一定的视力，类似于人类眼部皮肤白化病1类型的B亚型(OCA1B)。结合序列分析的结果，参考OCA1B的遗传机制［12］，可以推断，在家兔中由于TYR基因突变导致TYR基因表达量大幅度降低，酪氨酸酶功能低下，从而导致虹膜颜色表型的相应改变。

综上所述，本研究初步建立了家兔虹膜颜色性状从酪氨酸酶外显子DNA序列到mRNA表达量，最终影响虹膜颜色表型的粗略路线，根据实验结果推断T373K突变位点可能是决定家兔眼部虹膜组织色素沉淀的关键位点之一。家兔TYR基因表达量与虹膜颜色性状有相关性。而对家兔酪氨酸酶的彻底认识需要针对更多品种家兔的进一步比较实验。

哺乳动物酪氨酸酶的变化与肉眼直接可见的个体体表颜色性状相关，针对家兔酪氨酸酶的遗传和表达相关知识将有助于酪氨酸酶将来作为遗传标记，用于以家兔为模型动物的转基因和生物工程项目。

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Sequence and Expression of Tyrosinase Gene Variants in the Iris of Different Rabbit Strains

ZHU Liang，CAI Yue－qin，TU Jue，CHEN Min－li
(Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China)

Objective To compare the sequence and expression level of tyrosinase gene(TYR)among four rabbit strains covering a wide range in the extent of iris pigmentation and to verify the relationship between the tyrosinase gene and the iris colour of rabbits.Methods Exons of TYR were amplified and directly sequenced.The relative expression level of TYR in different strains of rabbits was analyzed by real－time quantitative PCR.Results The albino strains Japanese White and Rex rabbits showed a specific nucleotide exchange leading to an amino acid exchange(T373K)at the last N－glycosylation site.The silence nucleotide exchange(A→T)at nt870 of the tyrosinase coding sequence was observed in both the white hair black eyes(WHBE)and Chinchilla rabbits.A non－strain－specific amino acid exchange(V31M)was revealed in WHBE and Rex rabbits.The gene expression level of TYR in dark iris rabbits was significantly higher than that in non－pigmented ones.All results were corrected by the household gene GAPDH.Conclusions The nucleotide exchange at nt 1118(C→A)affect the function of tyrosinase，and the findings indicate that the gene expression level of TYR is related with the phenotype of iris color in rabbits.

Tyrosinase;Iris;WHBE rabbit;Japanese white rabbit;Chinchilla rabbit;Rex rabbit.

R33

A

1671－7856(2012)08－0001－05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.008.001

2012－05－31

浙江省自然基金项目(Y3090548)。

朱亮(1978－)，女，副研究员，博士，研究方向:动物分子遗传。E－mail:tozhuliang@126.com。