东北点地梅下胚轴再生体系的建立

吴丽巍，杨 阔，陶 双，杨文新，姜长阳

（辽宁师范大学生命科学学院，辽宁大连116081）

东北点地梅（Androsace filiformia）又称丝点地梅，属于报春花科点地梅属一年生草本植物。生长于河边、路旁、林下、荒地、湿地等环境中，主要分布在我国的东北、内蒙古等地区，其中，在辽宁省主要分布在沈阳、鞍山、凤城、新宾、西丰、开原、长海和桓仁等市县[1-2]。由于点地梅类植物含有黄酮类药用成分[3]，使东北点地梅作为中草药使用具有清热解毒、消肿止疼等功效，能治扁桃体炎、咽喉炎、口腔炎、急性结膜炎和跌打损伤等疾病[2]。近年来，辽宁地区家禽养殖专业户发现，把东北点地梅干粉作为饲料添加剂使用，能明显地降低家禽的发病率，提高经济效益。于是，很多人于每年的5—6月大量地采收东北点地梅用作家禽的饲料添加剂，这使本来分布和数量就很少的东北点地梅遭到了严重的破坏，导致在辽宁过去有东北点地梅分布的地区，现已几近绝迹。为保护东北点地梅的野生资源、满足人们的需求，研究者采用组织培养的方法，对东北点地梅进行了再生体系建立的研究。虽然有关植物组织培养方面的研究很多[4-8]，并且对点地梅丛生芽繁殖技术的研究也有报道[9]，但迄今未见东北点地梅组织培养和再生体系建立研究的报道。

本研究以东北点地梅有芽下胚轴为材料，采用组织培养的方法，建立起下胚轴的再生体系。

1 材料和方法

1.1 材料来源及灭菌

6月下旬，将生长于大连市长海县林下生长非常旺盛植株上的东北点地梅的种子采回实验室，采用高迎秋等[10]研究东方蓼的灭菌方法进行种子灭菌，可获得无菌种子。

1.2 培养条件

培养条件参见文献[11]。

1.3 试验方法

1.3.1 下胚轴愈伤组织的诱导培养 将无菌种子接种到1/2 MS培养基上，当实生苗长出一片真叶、下胚轴长0.5～0.9 cm时，在近培养基处将具有子叶和一片真叶的下胚轴剪下后，接种到以MS＋ZT 0.2 mg/L＋6-BA 0.1 mg/L为基本培养基、附加不同质量浓度的IAA，IBA和2，4-D培养基上，进行下胚轴愈伤组织的诱导培养试验。试验重复3次，每处理接种100个材料。

1.3.2 愈伤组织分化培养 把由下胚轴诱导培养的愈伤组织分散成4～8个颗粒组成、直径约为0.3 cm的块状后，接种到以MS＋NAA 0.1 mg/L为基本培养基，附加不同浓度6-BA，ZT，KT的培养基上，进行愈伤组织的分化培养试验。试验重复3次，每处理接种100块愈伤组织。

1.3.3 生根培养 向生长着继代增殖培养丛生不定芽的培养瓶倒入7 mL质量浓度为10 mg/L的IAA溶液，处理24 h后，将不定芽从基部分割为独立的不定芽，接种到1/2 MS培养基上，进行不定芽的生根培养。试验重复3次，第1次接种200个不定芽，第2次接种400个不定芽，第3次接种800个不定芽。

1.3.4 试管苗移栽与定植 把3次生根培养的试管苗长势较旺盛的植株从培养瓶中取出后，移栽到铺着一层6～8 cm厚干净河沙的温室苗床上。在移栽后前10 d（湿度保持90%左右、遮阴）对成活率及长势进行观察统计。

把移栽成活并正常生长的1 120株试管苗，于5月上旬一次性定植到大连郊区水库上游的草地上，按照野生条件任其生长。

2 结果及分析

2.1 不同质量浓度IAA，IBA和2，4-D对下胚轴愈伤组织诱导培养的影响

接种后56 d观察统计，结果列于表1。

表1 不同质量浓度IAA，IBA和2，4-D对下胚轴愈伤组织诱导培养的影响

由表1可知，在附加不同质量浓度IBA的培养基上，不能诱导下胚轴生长出愈伤组织；在附加不同质量浓度IAA的培养基上，下胚轴的愈伤组织的诱导率也很低；而在附加不同质量浓度2，4-D的培养基上，下胚轴愈伤组织的诱导率效果较好。其中，在附加2.1 mg/L的2，4-D培养基上，愈伤组织的诱导生长效果最好。不仅3次重复试验的平均诱导率达到了92.3%、半球状愈伤组织直径为1.6 cm，而且愈伤组织外观长势好。对培养过程的观察还表明，在附加2.1 mg/L的2，4-D培养基上，培养到9 d时就有约10%的培养材料在下胚轴的下部切口处生长出直径约为0.1 cm的淡黄色愈伤组织。之后，伴随着愈伤组织诱导率的增加，先生长的愈伤组织也不断地长大变绿，并且半球状愈伤组织的表面也呈现出大小不等的颗粒状。3次重复试验的结果基本一致。试验结果表明，MS＋ZT 0.2 mg/L＋6-BA 0.1 mg/L＋2，4-D 2.1 mg/L是东北点地梅下胚轴愈伤组织诱导培养的理想培养基。

2.2 不同质量浓度6-BA，ZT，KT对愈伤组织分化培养的影响及不定芽的继代增殖培养

接种培养60 d观察统计，结果列于表2。

表2 不同质量浓度6-BA，ZT，KT对愈伤组织分化培养的影响

由表2可知，在附加不同质量浓度KT的培养基上，愈伤组织不分化；在附加不同质量浓度6-BA的培养基上，愈伤组织的分化效果较差；在附加不同质量浓度ZT的培养基上，愈伤组织的分化效果较好。其中，在附加0.6 mg/L ZT的培养基上，不仅愈伤组织分化率最高，达到92%，平均每块愈伤组织能分化生长出5.6个不定芽，而且分化的不定芽长势较好。对分化培养的过程观察表明，附加0.6 mg/LZT的培养基上，培养10 d左右可见在愈伤组织块的上面分化出不定芽点，随后伴随着不定芽的不断生长，又会相继在先分化的不定芽基部分化出多个不定芽，且分化的不定芽呈丛生状。培养到60 d时，丛生状不定芽就会长成高1 cm左右、外观生长旺盛的丛生不定芽。

把这种丛生不定芽从基部切割为独立的不定芽后，接种到相同的培养基上进行不定芽分化继代增殖培养。3次重复试验的结果证明，经过50 d的分化继代增殖培养，平均1个不定芽就会分化继代增殖培养出4.6个不定芽，并且其外观长势比由愈伤组织分化培养的不定芽更旺盛。试验结果表明，MS＋NAA 0.1 mg/L＋ZT 0.6 mg/L是东北点地梅愈伤组织分化培养和不定芽的分化继代增殖培养的理想培养基。

2.3 不定芽的生根培养

接种后30 d统计，3次重复试验共接种的1 400个不定芽，生根株数为1 285个，平均生根率为91.8%。对生根培养过程的观察表明，接种培养到8 d时，绝大多数不定芽可发出新根，生长为试管苗。之后，伴随着试管苗的生长和生根率的增加，每株试管苗的根数也不断增加。培养到30 d时，平均每株试管苗会生长出6.7条白色根，且叶片伸展、嫩绿，长势旺盛。试验结果表明，用10 mg/L的IAA溶液对不定芽处理24 h，将不定芽接种到1/2 MS培养基上是东北点地梅不定芽生根培养的理想方法。

2.4 试管苗移栽与定植

3次共移栽1 197株，成活了1 126株，平均成活率为94.1%。定植后30d统计，成活1103株，成活率为98.5%。定植成活的试管苗外观生长旺盛，7月上旬开花，并保持野生东北点地梅的植物学性状。

3 讨论

本研究所定植的试管苗保持了东北点地梅的植物学性状，表明本研究所建立的再生技术，能够为东北点地梅野生资源的保护提供技术支撑。同时表明，采用现代无性繁殖技术，能对植物的种质资源进行保存。

在不定芽生根培养中，本研究采用10mg/L的IAA溶液对不定芽处理24 h，直接接种到1/2 MS培养基上生根的方法收到了较理想的效果，这与IAA特性和试管苗自身的合成力有关。IAA是一种植物自身合成的天然生长素，一定的质量浓度具有促进生根的作用。但是，在不定芽生根培养中，培养初期形成根原基时，需要较高质量浓度的生长素，而根伸长生长所需要的生长素质量浓度较低。而IAA这种天然生长素化学性质不稳定，在光照条件下容易分解。所以，用10 mg/L的IAA溶液对不定芽处理，使其促进形成根原基。之后，IAA的分解又有利于根原基的生长，促进试管苗的生根。实际上试管苗根的生长需要较低质量浓度的IAA，而在光照下培养的试管苗本身合成的IAA也能满足根生长的需要。

［1］中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴：第三分册[M].北京：科学出版社，1987：266.

［2］李书心.辽宁植物志：下册[M].沈阳：辽宁科学技术出版社，1991：22-24.

［3］李承花，尹志强，黄晓君，等.点地梅的化学成分[J].中国天然药物，2008，6（2）：123-125.

［4］郏艳红，王姝，刘仲齐.番茄下胚轴和子叶组织培养及植株再生的研究[J].天津农业科学，2012，18（1）:16-18.

［5］郑纯凤，丁莲，方晨，等.鹅绒委陵菜无性系建立及快速繁殖的研究[J].河北农业科学，2008，12（12）：569-572.

［6］于馨恒，刘兵，王春露，等.小天仙子组织培养研究[J].内蒙古农业科技，2011（3）：47-48.

［7］杨柳，李志东，张晨，等.蓬累悬钩子组织培养及试管苗繁殖的研究[J].天津农业科学，2012，18（4）：21-24.

［8］李响，王建华，李鑫，等.花蔺无性系建立的研究[J].河北农业科学，2011，15（3）：82-852.

［9］韩素菊，黎云祥，聂勇，等.点地梅丛芽技术研究[J].绵阳师范学院学报，2009，28（5）：67-70.

［10］高迎秋，孔祥慧，李肖依，等.东方蓼组织培养及无性系的建立[J].山西农业科学，2009，37（1）：15-18.

［11］马素娴，田志强，亢季萍.山西野生卷丹百合鳞茎组织培养[J].山西农业科学，2012，40（4）：319-321，377.