槲皮素体外抗氧化及对小鼠血脂代谢作用的研究

张才科，白 静，余 慧，沈正华，乐国伟

江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江南大学食品学院，无锡 214122

槲皮素体外抗氧化及对小鼠血脂代谢作用的研究

张才科，白 静，余 慧，沈正华，乐国伟*

江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江南大学食品学院，无锡 214122

本研究旨在探讨槲皮素体外抗氧化能力以及对高脂日粮小鼠血脂代谢的影响。体外分别测定了槲皮素对DPPH·，·OH和ABTS+·自由基的清除作用。动物实验:将昆明种雄性小鼠32只，随机分为4组，分别饲喂正常、高脂、高脂+0.05 g/kg槲皮素、高脂+0.1 g/kg槲皮素日粮。9周后测定小鼠肝脏活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量、抗氧化酶活力及血脂水平。结果表明:槲皮素对DPPH·，·OH和ABTS+·具有较强的清除作用，在一定范围内呈现出明显的剂量增加-效应增强的关系。0.05 g/kg槲皮素能显著降低肝脏自由基水平及MDA含量(P＜0.05)，增强抗氧化能力(P＜0.05)，改善血脂水平(P＜0.05)，而0.1 g/kg槲皮素效果不显著。结论:0.05 g/kg槲皮素可有效提高机体抗氧化能力，缓解高脂膳食造成的氧化应激，改善血脂代谢。

槲皮素;高脂日粮;氧化应激;抗氧化能力;血脂代谢

随着人民生活水平的提高以及食品加工业的日益发展，人们的膳食结构发生了很大的改变，特别是在一些大城市和经济发达地区，高脂高能膳食的摄入大增。研究表明高脂膳食尤其是饱和脂肪的大量摄入将导致机体肥胖、血脂代谢紊乱和氧化应激［1-4］。而血清总胆固醇(CHO)或低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高是发生冠心病和脑中风的重要因素之一［12，16］。目前高脂血症知晓率、治疗率和控制率低［17］，防治高血脂症，任重而道远。槲皮素(quercetin)是具有多种生物活性的黄酮类化合物，广泛存在于蔬菜水果，酒和茶叶中［18］。槲皮素对人体起着重要的保护作用，包括抗氧化及清除自由基作用、抗诱变作用、防止DNA氧化损伤、阻止炎症介质的释放等［19-23］。但槲皮素作为抗氧化剂对高脂日粮小鼠的血脂水平是否有影响尚未见相关报道，因此本文通过建立高脂动物模型诱导机体氧化应激，研究槲皮素对小鼠血脂代谢的影响，并研究了其适宜剂量，为提高居民生命质量及槲皮素作为血脂调节的功能性食品添加剂提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6 w龄雄性昆明种小鼠，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。

1.2 试剂

总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)定量测定试剂盒均购于(神州英诺华公司);总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。其余试剂为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 槲皮素体外抗氧化能力实验

槲皮素对 DPPH·自由基的清除能力参照Brand-Williams［24］提出的方法测定;对·OH自由基的清除能力用水杨酸法测定［25］;对ABTS+·自由基的清除能力参照Erkan［26］提出的方法测定。

1.3.2 动物实验的设计

清洁级雄性昆明种小鼠(体重:20±2 g)32只，饲喂正常日粮1周后，空腹称重，根据体重随机分为4组，即正常对照组(正常日粮)、高脂日粮组(高脂日粮)，槲低组(高脂日粮+0.05 g/kg槲皮素)，槲高组(高脂日粮+0.1 g/kg槲皮素)。正常和高脂日粮组成(表1)

表1 日粮组成(g/100 g)Table 1 Composition of diet(g/100 g)

1.3.3 动物饲养条件

小鼠同室分笼饲养，自然光照，自由采食和饮水。环境温度控制在(23±2℃)，湿度60%，饲养9周。

1.3.4 样品制备

实验结束时禁食12 h，然后乙醚麻醉，摘眼球取血分离血清(4℃，3000 rpm，10 min)，断颈椎处死小鼠，迅速取肝脏、心脏液氮速冻-70℃保存。10%组织匀浆的制备:准确称取0.5 g组织按1∶9(W/V)的比例加入预冷的生理盐水，在冰浴中用玻璃匀浆器手动匀浆。采用考马斯亮兰法测定匀浆液的蛋白质含量［8］。

1.4 指标的测定

1.4.1 血脂指标的检测

甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的测定均严格按试剂盒说明书操作。动脉粥样硬化指数AI=(TG-HDL-C)/HDL-C。

1.4.2 ROS水平的测定

参照luminal化学发光法［6，7］测定。

1.4.3 抗氧化指标的检测

总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的测定均严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5 数据处理和统计分析

数据处理和统计分析采用SPSS13.0软件进行方差分析和多重比较，结果以±s表示，显著水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 槲皮素体外清除自由基的能力

图1 槲皮素对DPPH·、·OH和ABTS+·自由基的清除能力Fig.1 Scavenging activities of quercetin on DPPH·，·OH and ABTS+·radicals

由以上图以看出槲皮素具有明显的清除DPPH·，·OH，ABTS+·自由基的作用，而且其清除能力随浓度的增加而逐渐增强，并呈线性相关，但增强趋势逐渐变缓。其中槲皮素对DPPH·自由基的清除能力最强。

2.2 槲皮素对高脂日粮小鼠血清脂质的影响

由表2可见，与正常组相比，高脂组小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量均显著增高，AI显著上升，HDLC显著降低。添加低剂量槲皮素可显著降低小鼠血清中TC、TG、LDL-C、AI水平，显著增大HDL-C含量，而添加高剂量槲皮素对高脂日粮小鼠血清脂质紊乱的缓解作用不如低剂量组显著。

表2 槲皮素对饲高脂日粮小鼠血清脂质的影响(n=8)Table 2 Effects of quercetin on serum lipid in mice fed with high-fat diet(n=8)

2.3 槲皮素对高脂日粮小鼠肝脏ROS水平的影响

由表3可见，与正常组相比，高脂组肝脏的ROS水平显著增高。添加低剂量槲皮素能显著降低高脂粮小鼠肝脏的ROS水平，而高剂量槲皮素对高脂日粮小鼠肝脏自由基水平清除作用不显著。

表3 槲皮素对饲高脂日粮小鼠肝脏ROS水平的影响(cd/mg tissue)Table 3 Effects of quercetin on the level of ROS in liver of mice fed with high-fat diet(cd/mg tissue)

2.4 槲皮素对高脂日粮小鼠血清抗氧化指标的影响

由表4可知，与正常组相比，高脂组小鼠肝脏CAT，GSH-Px，机体总抗氧化能力显著下降，MDA显著升高。在高脂日粮基础上添加低剂量槲皮素可显著提高小鼠血清的GSH-Px，总抗氧化能力及CAT，M D A显著下降。而在高脂日粮基础上添加高剂量槲皮素对提高小鼠血清抗氧化能力不显著。

表4 槲皮素对饲高脂日粮小鼠肝脏抗氧化能力的影响Table 4 Effects of quercetin on antioxidation capacity in liver of mice fed with high-fat diet

高脂组HFD 0.10±0.02a3.96±0.32a1099.40±393.75a0.34±0.09c高脂+0.05 g/kg槲皮素HFD+0.05 g/kg quercetin 0.28±0.04b5.76±1.37b5693.97±1338.30b0.21±0.02ab高脂+0.1 g/kg槲皮素HFD+0.1 g/kg quercetin 0.13±0.03a3.21±0.55a3893.20±474.26b0.28±0.01bc

2.5 自由基，抗氧化指标与血脂的相关分析

如表5可知MDA与TG、TC、AI呈正相关，与HDL-C呈负相关。ROS与LDL-C、AI呈正相关。CAT与LDL-C呈负相关。GSH-Px总值与AI呈负相关，与HDL-C呈正相关。

表5 自由基，抗氧化能力与血脂的相关性Table 5 The Correlation between free radical，antioxidation capacity and serum lipid

3 讨论

高血脂表现为血液中胆固醇和甘油三酯水平明显提高，是体内脂肪代谢紊乱的结果。高脂高能可引起机体氧化应激，生成大量自由基。本实验通过添加猪油同样证明了在大量脂肪刺激下，机体产生的自由基水平显著升高(P＜0.05)。血脂代谢与氧化应激之间存在联系，本实验结果结合相关性分析也说明:长期高脂日粮饲喂后，加重了代谢负担，使得脂类的吸收过程中自由基过量积累，机体抗氧化体系平衡被打破，引起机体氧化应激，过量的自由基会引起蛋白质发生交联、聚合、肽链断裂等多种损伤，导致血清及组织中的GSH-Px、CAT等抗氧化相关酶的活性受到显著的影响，导致T-AOC下降(P＜0.05)，生成大量自由基及MDA［8］。同时，机体的氧化应激能够阻碍线粒体对脂肪酸的利用，使得血液中脂肪酸水平急剧升高，导致脂肪酸调节失衡，血脂代谢异常［9］，升高了AI，增加了动脉粥样硬化的发生几率。在治疗由于高脂摄入导致的高血脂症时，从清除和控制机体组织自由基的角度出发，提高机体抗氧化能力，可缓解氧化应激。

GSH-Px和CAT是生物机体内重要的抗氧化酶即重要的活性氧自由基清除剂，在清除超氧自由基、H2O2和过氧化物以及阻止或减少羟基自由基形成等方面发挥重要作用［10，11］。T-AOC是全面反应机体抗氧化能力的指标。MDA的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。MDA的高低间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。

本实验利用高脂饲料建立小鼠高脂血症模型，结果显示，高脂模型组较正常对照组小鼠TC、TG和LDL-C含量显著增加(P＜0.05)，而HDL-C含量显著降低(P＜0.05)，表明小鼠高脂模型建立成功。此外，高脂模型组小鼠的肝脏MDA含量较正常对照组显著增加(P＜0.05)，而CAT、GSH-Px和 TAOC活力显著降低(P＜0.05)，说明高血脂症导致小鼠机体氧化一抗氧化状态失衡，致使抗氧化剂及细胞自由基清除酶活力下降以及脂质过氧化物含量的增加。

而与高脂模型对照组比较，低剂量槲皮素能显著改善小鼠的TC、TG、LDL-C和HDL-C水平，并提高肝脏抗氧化酶CAT和GSH-Px的活性，提高TAOC水平，降低MDA含量，表明槲皮素不仅可降低小鼠血脂，提高血液的抗氧化能力，而且还可降低肝脏的脂质沉积，可提高肝脏的抗氧化能力，降低动脉硬化指数，具有潜在的肝脏保护功能。

本实验结果表明槲皮素具有降低血清TC、TG和LDL-C，升高HDL-C的作用。槲皮素能通过抗氧化，清除自由基，其抗氧化活性主要来源于两个方面，其一，它具有极强保护和再生 α-生育酚的能力［15］:其二，它具有络合过渡金属离子(比如铁离子、铜离子等)的能力［13，14］。并升高自由基清除酶CAT，GSH-Px活力，提高机体T-AOC水平，显著降低脂质过氧化物产物MDA的含量，改善高脂血小鼠氧化-抗氧化失衡状态，从而减少因高脂血症产生的过量自由基对机体的损伤作用。

但本实验同时发现，高剂量槲皮素的作用效果并不显著，提示槲皮素对动物的降血脂作用需要一定的剂量，但并非高剂量越高，效果越好。这可能是由于槲皮素具有不同于一般药物的特殊性，只有在适当剂量下，才能表现出最佳的作用效果。当其剂量超出一定范围，过多的槲皮素会通过降低GSH-Px及其还原酶的浓度而转变成促氧化剂［26］。

实验证明:0.05 g/kg槲皮素的添加量可使高脂日粮小鼠的血脂，肝脏ROS水平及机体抗氧化能力恢复到接近正常日粮组水平，可认为是适宜剂量。

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Effect of Quercetin on Serum Lipid Metabolism of Mice and Its Antioxidant Activity in Vitro

ZHANG Cai-ke，BAI Jing，YU Hui，SHEN Zheng-hua，LE Guo-wei*
State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University; School of Food Science and Technology，Wuxi 214122，China

This study aimed to investigate the effects of quercetin on scavenging free radicals and serum lipid metabolism of mice fed with high-fat diet.The scavenging activities of quercetin on DPPH·，·OH and ABTS+·radicals were evaluated in vitro，respectively.Thirty-two male Kunming mice(weight:20±2 g)were randomly divided into 4 groups.They were fed with ordinary diet，high-fat diet，high-fat diet plus 0.05 g/kg quercetin and high-fat diet plus 0.1g/kg quercetin，respectively.After 9 weeks，the level of reactive oxygen species(ROS)in liver，contents of malondialdehyde (MDA)and antioxidant enzymes activities in liver and serum lipid level were determined.The results showed that quercetin had strong scavenging efficiencies on DPPH·，·OH and ABTS+· radicals.Moreover，the scavenging capability strengthened with its increasing dosages，although this enhancing trend gradually weakened.0.05 g/kg quercetin could remarkably decrease the level of ROS in liver and the content of MDA，enhance the antioxidant capacity of mice，as well as improve the level of serum lipid while 0.1 g/kg quercetin had no significant effects.The results indicated that 0.05 g/kg quercetin could effectively enhance antioxidant capacity，relieve oxidative stress caused by high-fat diet and improve serum lipid metabolism.

quercetin;high-fat diet;oxidative stress;antioxidant capacity;serum lipid metabolism

R285

A

1001-6880(2012)05-0663-05

2011-10-10 接受日期:2011-12-23

国家科教支撑计划课题(2012BAD33B05)

*通讯作者 Tel:86-510-85917789;E-mail:lgw@jiangnan.edu.cn